Visualización de la distribución de proteínas bacterianas en tres dimensiones mediante imagen de fluorescencia

Resumen

Fuente: Bratton, B. P., et al., Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demuestra el método para adquirir y analizar imágenes de fluorescencia tridimensionales de células bacterianas para estudiar la organización de proteínas a nivel de célula única.

Protocolo

1. Imagen

1. Inserta el portaobjetos sellado en el microscopio y déjalo reposar durante 5 minutos para equilibrar la temperatura con el entorno. La sala del microscopio puede estar a una temperatura diferente a la de la sala de preparación de muestras.
2. Toma una pila z fluorescente de la muestra.
   NOTA: La pila z debe cubrir completamente la muestra con un espaciado z menor que la profundidad del campo. Para una célula de E. coli con 1,45 NA 100x objetivo y ~1 μm de espesor, 40 pasos a 100 nm por paso funcionan bien. Para celdas más grandes o que no reposan perfectamente planas en la superficie, pueden ser necesarios 50 o más pasos. Incluye suficientes pasos y asegúrate de que la muestra esté completamente difuminada arriba e abajo.
   1. Utiliza el software asociado al microscopio (véase Tabla de Materiales) para controlar el microscopio.
   2. Enfoca en el centro de la célula usando las ruedas de enfoque del microscopio. Bajo adquisición ND, marca la casilla Z para tomar una pila z. Haz clic en el botón Inicio para establecer el centro de la celda como punto de inicio. Ajusta el tamaño del paso a 0,1 μm y el rango a 4 μm. Asegúrate de que el dispositivo Z esté configurado en la etapa piezo.
   3. Configura los canales fluorescentes bajo la ventana Lambda en la configuración de las moléculas fluorescentes que se están a imaginar. En este experimento se utilizaron GFP y mCherry.
      NOTA: Toma una pila z adicional con el mismo Tamaño de Paso y Rango en el segundo canal de color si se desea la distribución 3D de un canal fluorescente adicional. En este experimento, se utilizó mCherry citoplasmático para determinar la forma celular y MreB-GFP como segundo canal de color.
   4. Asegúrate de que el Orden del Experimento esté configurado en lambda (serie z) para que tome una pila completa de z en cada canal de color antes de cambiar.
   5. Haz clic en Ejecutar Ahora para iniciar la adquisición de imágenes y guarda el archivo una vez que una o ambas z-stacks estén completas.
   6. Muévete a una nueva zona de la plataforma y repite los pasos 1.2.2-1.2.5.

2. Reconstrucción celular

1. Recorta celdas individuales y guarda las imágenes como un archivo tiff apilado para que solo haya una celda por archivo. Asegúrate de que esta celda esté bien aislada de cualquier otra celda (es decir, aproximadamente 5 veces la mitad máxima de ancho total de la función de desenfoque en xy).
   NOTA: Esto puede hacerse utilizando software de análisis de imágenes disponible gratuitamente (véase Tabla de Materiales).
   1. Dibuja un cuadro alrededor de una celda individual y duplica esa celda dos veces, una vez por cada canal. Asegúrate de que la caja duplicada del hyperstack esté marcada y cambia el canal a 1 o 2, asegurándote de que las porciones incluyan toda la pila z.
      NOTA: Si solo se visualiza la forma de las células y no una proteína fluorescente adicional, solo habrá un canal presente.
   2. Una vez que ambas pilas estén disponibles, ve a Imágenes | Stacks | Herramientas | Concatena para combinar las imágenes primero con el canal de proteínas y luego con el canal de forma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Hisopo de algodón	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Antes aplicaba VaLaP
Hojas de cubierta	VWR	16004-302
Fiyi	ImageJ	https://fiji.sc	Usado para cro de células
Lanolina	Sigma-Aldrich	L7387	Combina con parafina y vaselina para hacer VaLaP
Medio de crecimiento LB	BD Difco	DF0446173
M63 media	E. UU.	M1015
MATLAB	Mathworks		Necesitaba ejecutar scripts de convolución hacia adelante
Portaobjetos de microscopio	Fisher	12-550-133
Elementos NIS	Nkon
Parafina	Sigma-Aldrich	327212
Vaselina	Equate	49035-038-27
Etapa Piezo z	Nikon	77011589
Puntas de pipete -p200	USA Scientific	1111-0730
Puntas de pipeta- p10	USA Scientific	1111-3730