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1. Determinación de los niveles de colonización intestinal
NOTA: La colonización intestinal es la métrica más útil en el modelo del pez cebra, ya que puede utilizarse para comparar la aptitud relativa de diversas cepas de V. cholerae o los efectos de mutaciones o knockouts génicos.
1. Eutanasia
1. Cuando el experimento ha alcanzado su punto final deseado, se toma una muestra del agua de infección (normalmente 15 mL son suficientes) para permitir el recuento de bacterias excretadas y la medición de diarrea (como el ensayo de mucina, contenido de proteínas y/o sobredosis), si se desea.
2. Vierte el resto del agua a través de una red (para recoger los peces) en lejía para eliminar a V. cholerae en el agua.
3. Colocar el pez en un vaso que contenga agua de infección más 336 μg/mL de metanosulfonato de etil 3-aminobenzoato (tricaína) e incubar el pez en esta solución de tricaína durante 20 minutos en RT.
NOTA: Las redes de rejilla fueron esterilizadas con una solución de lejía al 10%.
2. Disección
1. Preparación del pescado
1. Saca un pez de la solución de tricaína con una cuchara de plástico desechable y colócalo sobre la superficie de disección.
2. Coloca el pez con el lado ventral hacia arriba y sujeta el pez a través de la mandíbula inferior, con el extremo romo del alfiler inclinado hacia el otro lado respecto al centro del cuerpo. Coloca otro alfiler justo detrás del ano, también en ángulo alejado del cuerpo.
2. Exposición del tracto intestinal
1. Haz un hisopo en la superficie ventral del pez con una toallita sin pelusa sumergida en un 70% de etanol.
2. Esteriliza un bisturí y unas tijeras Vannas mojándolas en etanol al 70% y encendiéndolas con fuego.
3. Hacer una pequeña incisión a lo largo en el vientre, justo debajo de la piel, penetrando las escamas y usando el bisturí. Ten cuidado de no cortar demasiado profundo, ya que el tracto intestinal se encuentra justo debajo de la piel.
4. Con las tijeras, extiende la incisión con cuidado a lo largo del cuerpo, cortando no más profundo que la piel y evitando el ano.
5. Realizar dos cortes laterales con las tijeras hacia la cabeza del pez para permitir una apertura en la incisión.
6. Fija la piel a cada lado de las incisiones laterales a la superficie de disección, inclinando los pasadores hacia fuera, alejándolos del cuerpo.
NOTA: Las puntas de los alfileres se esterilizaban previamente con fuego con alcohol.
3. Extirpación del tracto intestinal
NOTA: El tracto intestinal debe ser visible como un tubo pálido y muy fino sobre los otros órganos.
1. Esteriliza con llama las pinzas y luego úsalas para extraer todo el tracto intestinal (normalmente de 12 a 15 mm de longitud). Colocar el intestino en un tubo de homogeneización que contiene cuentas de vidrio (véanse los pasos 1.3.1–1.3.2) y 1 mL de 1x PBS o LB, sobre hielo.
3. Homogeneización
1. Preparar los tubos de homogeneización con antelación vertiendo ~1,5 g de perlas de vidrio de 1 mm en tubos de 2 mL con tapa roscada (rellenarlos aproximadamente hasta la mitad) y luego esterilizarlos mediante autoclave.
2. Añadir 1 mL de LB estéril o 1x PBS.
3. Una vez añadidos los intestinos de pez cebra (paso 1.2.3.1) a los tubos, atornilla los tapones muy fuerte y luego asegura los tubos en el homogeneizador de vórtice.
4. Homogeneizar las muestras durante 1 minuto en la configuración máxima y luego enfriarlas sobre hielo durante 1–2 minutos. Repite este ciclo de homogeneización una vez más para lograr una homogeneización completa. Nota: También funcionarán varios métodos alternativos para la homogeneización.
4. Cuantificación de los niveles de colonización intestinal
1. Preparar tubos (ya sean pequeños tubos de ensayo de vidrio o tubos microcentrífugas de 1,5 mL) para la dilución en serie del homogeneado añadiendo 900 μL de LB o 1x PBS a cada tubo. Para cada pez, prepara 5–6 tubos y realiza diluciones en serie de 10 veces del homogenado intestinal añadiendo 100 μL de homogeneado al primer tubo, vórtizándolo para mezclarlo y luego añadiendo 100 μL del primer tubo al segundo.
2. Repite este procedimiento hasta que se hayan preparado todas las diluciones.
3. Placa de 100–200 μL de cada dilución en placas LB de agar que contienen 100 μg/mL de estreptomicina (si se utilizan cepas resistentes a estreptomicina) y 40 μg/mL de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido). Incubar las placas a 30 °C durante 16–18 horas.
4. Tras la incubación nocturna, contar las colonias de V. cholerae en las placas, ya sea usando un contador automático de colonias o contando manualmente las colonias; Es útil marcar las colonias contadas con la punta de un marcador.
5. Determinar la UFC por intestino de pescado multiplicando el recuento de placas por el factor de dilución de la suspensión, teniendo en cuenta el volumen que se emplacó.