Colonización intestinal e inducción de diarrea por Vibrio cholerae en peces cebra adultos

Resumen

Fuente: Nag, D., et.al. Cuantificación de la colonización y diarrea por Vibrio cholerae en el modelo de pez cebra adulto. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demuestra la inoculación de peces cebra adultos con una cepa patógena de Vibrio cholerae para estudiar la colonización intestinal y los resultados de enfermedades. Muestra cómo las toxinas bacterianas alteran la integridad intestinal, provocando fugas de líquido, secreción de moco y diarrea acuosa antes de que los peces estén preparados para un análisis posterior.

Protocolo

1. Inoculación de pez cebra por inmersión
   NOTA: Este método de exposición se asemeja al curso natural de la infección.
   1. Preparación de Vibrio cholerae
      1. Inocular 5 mL de caldo de lisógeno (LB) con una colonia aislada de V. cholerae de una placa LB e incubarla a 37 °C con agitación (180 rpm) durante 6–8 horas (cultivo nocturno).
      2. Inocular 25 mL de medio LB fresco autoclavado en un matraz cónico de 250 mL con 50 μL del cultivo nocturno anterior. Incubarla durante 16–18 horas a 37 °C con agitación (150 rpm).
      3. Lee la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de una dilución 1/10 del cultivo nocturno para estimar el número de bacterias por mL (el OD₆₀₀ = 1 es ~10⁹ UFC/mL).
      4. Extrae las células por centrifugación a 6.000 g durante 10 minutos. Retira el material con una pipeta o viértelo en una solución desinfectante. Resuspende las células en PBS estéril hasta la concentración deseada, típicamente entre 1 x 10⁷ a 1 x^{10 10} por ml de PBS.
         NOTA: Aquí, nos referimos al agua de ósmosis inversa autoclave que contiene 60 mg/L de sales marinas como agua de infección estéril.
   2. Inoculación e incubación
      1. Coloca cuatro o cinco peces cebra en un vaso de precipitados de 400 mL que contenga 200 mL de agua estéril de infección.
      2. Añade 1 mL de V. cholerae para obtener la concentración deseada de infección (normalmente 5 x 10⁴ a 5 x 10⁷ UFC/mL) en 200 mL de agua infectada.
      3. Cubrir el vaso con una tapa perforada para evitar que el pez salte; la parte superior de una caja de punta de 200 μL funciona bien para esto.
      4. Etiqueta cada vaso y colócalos en una incubadora de frente de cristal colocada a 28 °C durante la duración del experimento.
   3. Procedimiento para la exposición transitoria
      NOTA: Una exposición transitoria a V. cholerae (normalmente 6 horas) seguida de la eliminación de las bacterias inoculadoras es útil para estudiar la transmisión y para la cuantificación más precisa de las bacterias excretadas.
      1. Tras 6 horas de exposición, vierte el agua del vaso a través de una red para recoger los peces. Descarta el agua infectada en un recipiente de lejía para matar a V. cholerae.
      2. Coloca el pez retirado en un vaso de precipitados con 200 mL de agua estéril de infección. Deja que los peces naden en esta agua limpia durante 5 minutos para eliminar las bacterias superficiales.
      3. Repite el procedimiento con red y coloca el pez en un vaso nuevo con 200 mL de agua estéril para infección. Mantén el pez en este vaso durante todo el experimento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Instrumento
Incubadora	NUAIRE, Plymouth, MN	Flujo automático
Materiales
Vasos de precipitados de vidrio de 400 ml	Pyrex
Tapas perforadas	Portapuntas con agujeros de la caja de puntas
Sistema de acuario	Aquaneering, San Diego, CA
Purificador de agua de ósmosis inversa	Aqua FX	TK001
Red de pesca	Marina
Alimento para peces	Aleta tetra
Placa de Petri	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
Tubo centrífugo de 1,5 ml	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Tubos de ensayo	Pyrex	9820
Micropipetas	Sartorius Biohit, Göttingen, Alemania	M1000/M200/M20
Consejos	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB medium
Triptón	Licenciatura en Biociencias, San José, CA	211705
Extracto de levadura	Licenciatura en Biociencias, San José, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	Licenciatura en Biociencias, San José, CA	214010