$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparación de placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) para probar los efectos de diferentes bacterias sobre la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans)
- Coloca 1,25 g de peptona, 1,5 g de NaCl, 8,5 g de agar, un agitador magnético y 487,5 mL de agua destilada en una botella de cristal de 500 mL.
- Mezcla bien la mezcla, déjala en autoclave durante 15 minutos a 121 °C y enfría la mezcla a 55 °C en baño María durante 30 minutos.
- Retira el medio del baño maría, añade los componentes (0,5 mL de 1 M CaCl2, 0,5 mL de colesterol, 0,5 mL deMgSO 4, 12,5 mL de KPO4) al NGM y mezcla bien.
NOTA: Todos los componentes individuales deben ser autoclavados excepto el colesterol (disuelto en etanol absoluto), y cada paso experimental debe realizarse en un banco limpio. - Distribuye 20 mL de NGM en cada placa de Petri de 90 x 15 mm y deja que el agar solidifique sobre un banco limpio a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). Las placas NGM pueden almacenarse hasta un mes a 4 °C.
NOTA: El protocolo puede pausarse aquí. Se prepararon las placas NGM utilizadas para la tinción con FITC-dextrán (fluoresceína isotiocianato-dextran). Se distribuyeron 10 mL de NGM a cada placa de Petri de 60 x 15 mm y se dejaron solidificar sobre un banco limpio a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). - Retira el cultivo bacteriano del frigorífico de 4 °C y haz un vórtice en el cultivo a fondo antes de extenderlo sobre las placas NGM.
- Añade un total de 800 μL del cultivo bacteriano a cada placa nueva de NGM y deja que las placas se sequen en una incubadora a 20 °C durante la noche.
NOTA: Para el primer experimento (Figura 1), se prepararon dos placas NGM con E. coli OP50, una placa NGM con P. aeruginosa PAO1 y una placa NGM con E. faecalis KCTC3206. Para el segundo experimento (Figura 2), se prepararon dos placas NGM con E. coli vivo OP50, una placa NGM con P. aeruginosa vivo PAO1 y una placa NGM con P. aeruginosa PAO1 inactivada por calor.
3. Preparación de C. elegans sincronizados con la edad
- Cultiva lombrices en una placa sólida de NGM y aliméntalos con E. coli OP50 hasta alcanzar la población deseada.
- Sincroniza los huevos utilizando el método de puesta cronometrada o el tratamiento con solución blanqueadora
4. Tratamiento de bacterias y alimentación con FITC-dextrán
- Incubar los huevos sincronizados con la edad a 20 °C durante 64 horas en placas NGM complementadas con E. coli viva OP50 como alimento.
- Lava las larvas L4 sincronizadas con la edad con un buffer S y transfiere (más de aproximadamente 500 gusanos) a las placas NGM de tratamiento que contienen diferentes bacterias y productos químicos. Incubarlos a 20 °C durante 48 horas.
NOTA: El tiempo de tratamiento puede oscilar entre 24 y 72 horas, según las bacterias y los productos químicos utilizados. El efecto terapéutico o preventivo de la DIM también puede evaluarse pretratando los gusanos con patógenos y luego tratándolos con DIM (el efecto terapéutico) o pretratándolos con DIM y luego con patógenos (efecto preventivo). - Para preparar las placas suplementadas con FITC-dextran, mezcla 2 mL de E. coli OP50 inactivada por calor con 4 mg de FITC-dextran. Luego, divide 100 μL de la mezcla de FITC-dextrán y E. coli OP50 en veinte placas de agar NGM frescas (60 mm x 15 mm) y deja que las placas se sequen durante 1 hora en un banco limpio.
NOTA: La concentración final de FITC-dextrán en cada placa NGM será de 20 μg/mL. - Prepare cinco placas NGM que contienen E. coli OP50 sin FITC-dextran para el tratamiento de control del vehículo. Para ello, divide 100 μL de E. coli OP50 inactivada por calor en cada placa de agar NGM fresca (60 mm x 15 mm) y deja que las placas se sequen durante 1 hora en un banco limpio.
NOTA: Para cada experimento independiente se requieren quince placas NGM suplementadas con FITC-dextran y cinco placas NGM sin FITC-dextrán. - Tras 48 horas de tratamiento (del paso 7.2), lavar los gusanos con S-buffer, transfiere los gusanos a las placas suplementadas con FITC-dextrán y a las placas NGM sin FITC-dextran, e incubar las placas durante la noche (14–15 horas).
NOTA: Para cada grupo de tratamiento, se requieren 5 réplicas de la tinción FITC-dextrán (o alimentación de control del vehículo). - Lava las lombrices con S-buffer y déjalas deslizarse en la placa de agar NGM fresca durante 1 hora.
NOTA: Para cada experimento independiente, se necesitan un total de 20 placas NGM frescas. En este paso, puedes usar la placa NGM complementada con o sin E. coli OP50. - Añade 50 μL de solución de formaldehído al 4% a cada pozo de una placa negra de fondo plano de 96 pozos. Transfiere aproximadamente 50 gusanos de cada placa NGM a cada pozo para mediciones de fluorescencia. Después de 1 a 2 minutos, retira completamente todo el formaldehído de cada pozo y añade 100 μL de medio de montaje para recubrir los pozos.
NOTA: Se utiliza solución de formaldehído (4%) para inmovilizar y fijar los gusanos. Para cada grupo de tratamiento, se utilizan 5 pozos (5 réplicas) para el análisis de imágenes.
5. Imagen de C. elegans con el Sistema de Imagen de Opereta y Determinación de la Permeabilidad Intestinal mediante la Medición de la Captación de Fluorescencia de FITC-dextrán
NOTA: La estereomicroscopía fluorescente puede utilizarse para el análisis de imágenes en lugar del sistema Operetta.
- Captura imágenes de fluorescencia y mide la intensidad de fluorescencia usando el Sistema de Imagen de Alto Contenido Operetta y analiza las imágenes con el software Harmony.
- En el software Harmony, pulsa el icono Abrir tapa para abrir la tapa y meter la placa en la máquina.
- Establece los parámetros.
- Haz clic en Configurar, selecciona el tipo de placa (fondo plano de Corning de 96 pozos) y añade los canales (campo claro y canales EGFP).
- Ajusta la distribución. Ve a la selección de Layout, luego selecciona Track y ajusta los parámetros (la primera imagen a 1 μm, el número de planos es 10, la distancia es 1 μm).
- Selecciona uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura y pulsa Probar para comprobar si las imágenes son satisfactorias en la sección de Ejecutar experimentos .
- Si las imágenes son satisfactorias, vuelve a la sección de Configuración y pulsa el icono de Reiniciar al final de la pantalla. Luego, selecciona todos los pozos objetivo y un número adecuado de campos de captura.
- Ve a Ejecutar experimento de nuevo e introduce el nombre de la placa, luego pulsa Start para empezar el procesamiento.
- Para medir la intensidad de la fluorescencia, ve a la sección de análisis de imágenes e introduce la imagen. Encuentra la célula eligiendo el canal EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) y el método B. Ajusta el umbral común a 0,5, el área a >200μm 2, el factor de división a 3,0, el umbral individual a 0,18 y el contraste a más de 0,18. Luego, calcula las propiedades de intensidad y elige la media como salida. Pulsa el icono Aplicar para guardar la configuración.
- Ve a la sección de Evaluación para medir la intensidad obteniendo un mapa de calor y una tabla de datos. Establece el parámetro de lectura a Células — Unidad de Intensidad Medio EGFP — Media por pozo y comienza la evaluación.
NOTA: El protocolo puede pausarse aquí. - Para extraer los datos de Operetta, haz clic en el botón Configuración y elige Gestión de datos.
- Elige Escribir archivo, luego abre la búsqueda y selecciona el archivo.
- Para seleccionar el archivo, haz clic en la señal pequeña + en la esquina izquierda, luego haz clic en Medición y elige Nombre de la placa.
- Selecciona el archivo y haz clic en Aceptar.
- Selecciona la ruta para guardar el archivo haciendo clic en la señal Explorar en la ruta activa.
- Haz clic en Iniciar para guardar el archivo de datos.
NOTA: El protocolo puede pausarse aquí.
