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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
1. Preparación de cultivos de Salmonella Typhimurium ΔAroA para gavage oral de ratones
- A partir de un stock congelado de glicerol de S. Typhimurium ΔAroA, preparar una placa de raya utilizando agar Luria-Bertani (LB agar) que contenga 100 μg/mL de estreptomicina con un lazo inoculante estéril. Incubar durante la noche a 37 °C. Las placas de raya pueden almacenarse hasta una semana a 4 °C.
- Un día antes de la infección, prepara el antibiótico disolviendo 0,5 g de estreptomicina en 2,5 mL de agua. Tras esterilizar la solución de estreptomicina con filtro, se aplica a los ratones por vía oral usando una aguja de 22 G con punta de bulbo y 1 mL de jeringuilla con 100 μL de solución de estreptomicina (20 mg de estreptomicina/dosis). Utilizando un lazo inoculante, inocúla 3 mL de LB de caldo (50 μg/mL estreptomicina) en un tubo de cultivo con una sola colonia. Incubar el cultivo de Salmonella aeróbicamente a 37 °C durante la noche con agitación a 200 revoluciones por minuto (RPM).
- El día de la infección, prepare la dosis final realizando 2 diluciones consecutivas de 1/10 de cultivos nocturnos de Salmonella en solución salina con fosfato tamponado estéril (PBS). Esto resultaría en un inóculo de 100 μL que contiene aproximadamente 3 x 106 Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
- Utilizando una aguja de gavage de 22G con punta de bulbo y una jeringuilla de 1 mL, se aplica a cada ratón 100 μL de la salmonela preparada.
NOTA: Prepara cultivos de Salmonella utilizando técnicas asépticas. La concentración final de inoculación de Salmonella puede verificarse mediante diluciones en serie de placas en agar LB con estreptomicina.
2. Evaluación de la carga de Salmonella en los tejidos
- Prepara microtubos de fondo redondo de 2 mL con seguro y 1 mL de PBS estéril y una perla de acero inoxidable autoclavada. Prepesa los tubos antes de la recogida de tejido.
- Resecar los tejidos cecal y esplénico de ratones sacrificados por exposición al dióxido de carbono. Recoge tejido de animales individuales en tubos separados. Pesa los tubos para determinar el peso del tejido.
- Homogeneizar usando un aparato mezclador durante 15 minutos a 30 Hz. Transfiere 900 μL de PBS por pozo en un megabloque de 96 pozos de 2 mL. Pipetear 100 μL de tejido homogenea en el primer pozo, mezclar bien y realizar diluciones en serie añadiendo 100 μL a los pozos posteriores hasta obtener una dilución de 10⁻⁶. Lámina 10 μL de cada dilución triplica sobre agar LB que contenga 100 μg/mL de estreptomicina.
- Contar y multiplicar la media de la UFC por un factor de 100, ya que 10 μL de la muestra de 1000 μL fueron placados y el factor de dilución adecuado. Divide el peso total de la UFC tisular por los pesos tisulares para determinar la UFC por gramo de tejido.
NOTA: Mantén todas las muestras en hielo o a 4 °C durante el procesamiento del tejido. Utiliza puntas de pipeta de orificio ancho al realizar diluciones en serie con homogeneados tisulares. Prepara con antelación el megabloque de 96 pozos que contiene PBS.