Preparación del inóculo de Gardnerella vaginalis para modelar infecciones urinarias recurrentes en ratones

Resumen

Fuente: O'Brien, V.P. et al. Infección urinaria recurrente por Escherichia coli desencadenada por la exposición a la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo muestra la preparación de un inóculo de Gardnerella vaginalis para establecer un modelo murino de infección urinaria recurrente.

Protocolo

1. Prepara el inóculo de Gardnerella vaginalis
   NOTA: Todos los pasos se realizan en una cámara anaeróbica. Los tiempos ideales de incubación en cultivo varían entre diferentes cepas de G. vaginalis, con algunas cepas entrando en la fase estacionaria e incluso comenzando a morir más rápido que otras. Por tanto, los tiempos de incubación deben determinarse empíricamente para una cepa dada antes de realizar experimentos en ratones. Se desconoce si otras o todas las cepas de G. vaginalis provocarán los mismos efectos en este modelo.
2. Cepa Streak G. vaginalis de un caldo congelador a -80 °C sobre un plato NYCIII (sin antibióticos). Incubar la placa a 37 °C anaeróbicamente durante 24 horas.
3. En la cámara anaeróbica, inocúla 5 mL de medios anaeróbicos NYCIII con un lazo de 1 μL de células (una sola colonia es insuficiente) de la placa NYCIII e incuba un cultivo estático a 37 °C bajo condiciones anaeróbicas durante 18 horas. No incluyas antibióticos en el medio de cultivo.
4. Determinar el OD⁶⁰⁰ del cultivo usando un espectrofotómetro
   1. Centrifugar un volumen definido (X) de cultivo a 9600 × g durante 1 minuto y aspirar el medio. Calcula el volumen (Y) de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para volver a suspender el pellet y así lograr la densidad óptica (OD) deseada del inoculo y así lograr 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC) en 50 μL usando la siguiente ecuación: X mL × ODcultivo = Y mL ^{× inóculo} OD, resuelve para YY = (X ml × ODcultivo) / ^{OD inóculo}
      NOTA: El ^inóculo de OD para JCP8151B^SmR es 5, pero esto debe determinarse empíricamente para otras cepas de G. vaginalis . Por ejemplo, si se centrifuga 3 mL de un JCP8151B^SmR durante la noche con cultivo líquido ODculture = 2,0: Y= (3 mL × 2,0) / 5,0; por lo tanto, resuspender el pellet en 1,2 mL PBS.
   2. Resuspende el pellet bacteriano en PBS hasta la concentración deseada. Diluye y placa en serie el inóculo para determinar la dosis real del inóculo que se ha utilizado en cada experimento. No te fies solo de los valores de OD.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glucosa	Sigma	G7528	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-ácido etanolsulfónico (HEPES)	Cellgro	25-060-Cl	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
Cloruro de sodio	Sigma	S3014	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
Proteosa peptona #3	Fisher	DF-122-17-4	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
Extracto de levadura	Fisher	DF0127-17-9	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
Espectrofotómetro	BioChrom	80-3000-45	Medición de la bacteria OD600
Estreptomicina	Gibco	11860038	Añadir a G. vaginalis placas selectivas NYCIII (1 mg/mL)