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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
1. Inoculación intranasal de ratones con Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) cultivado en biofilm
- Compra ratones y úsalos a la edad deseada.
NOTA: Se prefieren ratones de 3 a 4 meses para modelar hospedadores jóvenes, y ratones de 21 a 24 meses pueden usarse para modelar a personas mayores de >65 años. Los datos presentados aquí son de ratones machos C57BL/6. - Descongela las alicotas bacterianas cultivadas en biofilm sobre hielo y centrifuga a 1.700 × g durante 5 minutos. Retira y desecha cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet, lava las bacterias volviendo a suspender el pellet en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), y vuelve a centrifugar a 1.700 × g durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el volumen necesario para alcanzar la concentración deseada (apunta a 5 × 10 unidades formadoras de6 colonias (UFC)/10 μL para la inoculación intranasal). Confirma la cantidad de bacterias administradas colocando el inóculo preparado sobre placas de agar sanguíneo.
- Inocular los ratones por vía intranasal con 5 × 106 UFC pipeteando 5 μL del inóculo diluido en cada naris. Asegúrate de sujetar los ratones firmemente, estabilizando la cabeza, hasta que se inhale el volumen (normalmente en cuestión de segundos tras pipetear el volumen en las narinas). Realizar este paso en ausencia de anestesia para evitar la aspiración pulmonar del inóculo.
2. Infección viral con el virus de la gripe A (IAV)
- A las 48 horas tras la inoculación intranasal con S. pneumoniae, descongelar la cepa IAV de interés sobre hielo.
NOTA: Los datos presentados aquí corresponden a una cepa adaptada al ratón del virus de la gripe A A/PR/8/34 H1N1 obtenida mediante intercambio colaborativo. - Una vez que el virus se ha descongelado, se diluye el virus en PBS hasta la concentración deseada; apunta a 20 unidades formadoras de placa (PFU)/50 μL para infección intratraqueal y 200 PFU/10 μL para infección intranasal. Para grupos de simulados infectados y solo bacterias, utiliza PBS para inocular a los ratones.
- Coloca lubricante oftálmico en los ojos de los ratones antes de la anestesia. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 5% y confirmar la anestesia con un pellizco firme en el dedo del pie.
- Una vez anestesiado, se extrae del compartimento de isoflurano e infecta inmediatamente a los ratones anestesiados con 50 μL (20 PFU) de IAV intratraquealmente usando pinzas romas para extraer la lengua de la boca y pipetear el volumen de líquido por la tráquea.
- Coloca a los ratones en una jaula separada y monitorea hasta que se recupere completamente (pueden mantener la reclinación esternal [pueden tumbarse erguidos sobre el pecho]).
- Tras la recuperación, inocular inmediatamente intranasal a los ratones con 10 μL (200 PFU) de VAI utilizando el método de inoculación en el paso 1.3.
- Ratones domésticos que han sufrido una o dos infecciones bacterianas y virales con el mismo grupo de infección y se han separado de los otros grupos.