Procesamiento de tejidos infectados para la enumeración bacteriana en un modelo de coinfección en ratones

Abstract

Fuente: Lenhard, A., et al. Un modelo murino para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad agravada por la edad. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo muestra el procesamiento de los pulmones de un ratón coinfectado con una bacteria patógena y un virus. La trituración, homogeneización y placado del tejido pulmonar permiten cuantificar la carga bacteriana, lo que indica la propagación bacteriana a los pulmones y la gravedad de la enfermedad.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Procesamiento de tejidos infectados para la enumeración bacteriana

1. Colección pulmonar
   1. Con tijeras de disección, haz un corte por los lados de la caja torácica expuesta y tira suavemente de las costillas hacia la cabeza del ratón para exponer el corazón. Inserta una aguja de 25 g unida a una jeringuilla de 10 mL prellena con solución fisiológica con suero (PBS) en el ventrículo derecho y comienza a perfundir lentamente. Busca blanqueamiento pulmonar como indicador de una perfusión exitosa. Enjuaga lentamente para evitar romper el tejido pulmonar.
   2. Levanta el corazón con las pinzas y haz un corte para separar los pulmones y el corazón. Una vez separados, recoge todos los lóbulos del pulmón con la pinza y enjuágalos en un recipiente con PBS estéril para eliminar cualquier residuo de sangre. En una placa de Petri, pica los pulmones en trozos pequeños y mezcla bien. Retirar la mitad de la mezcla pulmonar para determinar las unidades formadoras de colonias bacterianas (UFC) o unidades formadoras de placas virales (PFU) y colócala en un tubo de fondo redondeado de 15 mL prellenado con 0,5 mL de PBS para homogeneización.
      NOTA: Es importante no tomar diferentes lóbulos del mismo pulmón para las distintas evaluaciones. En su lugar, todos los lóbulos deben ser picados, mezclados bien y distribuidos por igual para las diferentes evaluaciones.
2. Para homogeneizar el tejido recogido, primero limpia la sonda homogeneizadora poniéndola en etanol al 70% y encendiendo el homogeneizador al 60% de potencia durante 30 segundos. Repite el paso en agua estéril durante 10 segundos. Homogeneiza cada tejido durante 1 minuto. Limpia la sonda homogeneizadora en agua estéril entre cada muestra y en un tubo fresco de etanol al 70% entre cada órgano y grupo muestral.
3. Enumeración de números bacterianos
   1. Una vez que todos los órganos han sido extraídos y homogeneizados, se producen diluciones seriadas en placas de agar en sangre. Para calcular la UFC total, utiliza 10 μL para placar y anota el volumen final en mL de cada muestra. Incubar durante la noche a 37 °C/5% de CO₂.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jeringuillas desechables BD con puntas Luer-Lok (1 mL)	Fisher	14-823-30
Tijeras delicadas de disección Fisherbrand	Fisher	08-951-5	Instrumentos utilizados para la cosecha
Fisherbrand diseccionando pinzas tisulares	Fisher	13-812-38	Pinzas para la cosecha
Jeringuillas estériles Fisherbrand para un solo uso (10 mL)	Fisher	14-955-459