Generación de una monocapa colonoide humana con función barrera para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Resumen

Fuente: In, J. G., et al. Monagocapas colonoides humanas para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y el epitelio intestinal del huésped. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo muestra el procedimiento para cultivar células epiteliales derivadas del colon en un sistema Transwell recubierto de colágeno para generar una monocapa productora de moco que modela la barrera intestinal y permite estudios de interacción huésped-patógeno.

Protocolo

1. Recubriendo la suspensión enteroide/colonoide

1. Si los insertos recubiertos se almacenaron a 4 °C, se equilibran en una incubadora de cultivo tisular a 37 °C/5% CO₂ durante al menos 30 minutos antes de la formación de placas celulares.
2. Para cada inserto a placar, prepare 1 mL de medio de expansión tibio (entre 25-37 °C) y añada 10 μM Y-27632 y 10 μM CHIR 99021.
   NOTA: La EM está compuesta por DMEM avanzado (Medio Águila Modificado de Dulbecco) /F12 que contiene B27 (1x), medio acondicionado con 50% WNT3A, medio acondicionado con RSPO1 al 15%, medio acondicionado con Noggin al 10%, 50 ng/mL EGF humano (Factor de Crecimiento Epidérmico), 500 nM A-83-01, cóctel antibiótico/antimicótico (1x) de 10 mM, hepes (N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfónico)), Dipéptido de L-alanil-L-glutamina (1x) y penicilina-estreptomicina (1x) (véase Tabla de Materiales).
3. Aspira el medio de lavado del tubo que contiene la pelota celular y vuelve a suspender en un volumen de EM suficiente para obtener al menos 100 μL/inserto.
4. Aspira la solución intravenosa de colágeno de cada inserto y lava dos veces con 150 μL del medio de lavado por inserto.
5. Pipetear 600 μL de EM en el espacio bajo cada inserto.
6. Pipete 100 μL de suspensión de celda en cada inserto.
7. Devuelve la placa a la incubadora de cultivo de tejidos y déjala sin molestar durante al menos 12 horas.
   NOTA: Evita agitar o inclinar bruscamente la placa para evitar una distribución desigual de fragmentos de colonoides sobre la membrana insertada.
8. Monitoriza la unión y dispersión de la célula para formar una monocapa confluente colocando la placa sobre un microscopio óptico de contraste de fase bajo una lente objetivo 2,5x-10x.
9. Tras 1-2 días, la mayoría de los fragmentos deberían adherirse a la matriz de colágeno. Renova el medio de cultivo y suspende el tratamiento con Y-27632 y CHIR 99021. Sigue renovando el medio cada 2-3 días hasta que esté en confluencia. La confluencia generalmente se alcanza en 7-10 días.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Base de tris, componente del buffer de lisis
A-83-01	Tocris	2939	Inhibidor de ALK4/5/7
Ácido acético, glacial	Fisher Scientific	A38
DMEM/F12 avanzado	Tecnologías de la vida	12634-010	Componente del medio de cultivo
Cóctel antibiótico/antimicolético	Invivogen	ANT-PM-2	Primocina (100x)
B27, 50x	Tecnologías de la vida	17504-044	Componente del medio de cultivo
Insertos de cultivo celular	Corning	3470	Transwell, membrana PET, poro de 0,4 μm, placa de 24 pozos
CHIR 99021	Tocris	4423	Inhibidor de GSK3β
Colágeno IV, de la placenta humana	Sigma	C5533
Solución de extracción de organoides Cultrex	Trevigen	3700-100-01	Despolimeriza la matriz de membrana basal
Etanol, absoluto	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Tecnologías de la vida	35050-061	Dipéptido L-alanil-L-glutamina, 200 mM
HEK293T/Línea celular Noggin-Fc	Laboratorio van den Brink, Instituto Tytgat de Investigación del Hígado e Intestinos		Para la producción de medio acondicionado con Noggin
HEK293T/RSPO1-Fc-HA	Trevigen	3710-001-K	Para la producción de medio acondicionado Rspondin-1
HEPES, 1 M	Tecnologías de la vida	15630-080	Componente del medio de cultivo
Factor de crecimiento epidérmico humano (EGF)	Sistemas de I&D	236-EG-01M	Componente del medio de cultivo
Microscopio óptico invertido de cultivo celular	Olimpo	CKX51
Línea celular L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	Para la producción de medio acondicionado Wnt3a
Matrigel, factor de crecimiento reducido	Corning	356231	Matriz de membrana basal para cultivo 3D
Mini rascador de celda	United BioSystems	MCS-200
Anticuerpo MUC2, monoclonal de ratón	Abcam	ab11197	Úsalo a 1:100 para inmunotinción, 1:500 para inmuno-absorbente
Partículas lentivirales de SHRNA MUC2	GE Dharmacon	RHS4531	ARNh lentiviral GIPZ, ID: 4583
Agitador orbital	Instrumentos de subvención	PSU-10i
Penicilina-estreptomicina, 100x	Tecnologías de la vida	15140-122	Componente del medio de cultivo
Sonda sonicadora con micropunta	Ultrasonidos de Branson	450
Cóctel inhibidor de proteasas para células mammifèras	Sigma	P8340	Componente del tampón de lisis
SB 202190	Tocris	1264	Inhibidor de MAPK p38
Cloruro de sodio	Sigma	S3014	Componente del tampón de lisis
Dexoicocolato sódico	Sigma	D6750	Componente del tampón de lisis
Dodecilo sulfato de sodio	Sigma	L3771	Componente del tampón de lisis
TrypLE Express, 1x	Tecnologías de la vida	12605-010	Tripsina, para digerir fragmentos enteroides/colonoides
Anticuerpo vinculina, monoclonal de conejo	Abcam	ab129002	Úsalo a 1:1000 para inmunoabsorbente
Agua, grado cultivo tisular, estéril filtrado	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	Inhibidor de RhoA/ROCK