Generación de esferoplastos a partir de bacterias gramnegativas

Resumen

Fuente: Figueroa, D. et al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo muestra la preparación de esferoplastos a partir de bacterias gramnegativas en forma de varilla. Las bacterias se cultivan en presencia de un antibiótico para formar filamentos alargados. Estos se lavan con una solución hipertónica y se tratan con un tampón de lisis para eliminar la pared celular externa. El tratamiento hipotónico forma esferoplastos, que se estabilizan con una solución isotónica fría y se almacenan en condiciones frías.

Protocolo

1. Preparación de la solución

NOTA: Preparar las soluciones descritas en los pasos 1.1–1.9 para producir esferoplastos de Escherichia coli (E. coli )

1. Preparar 1 M de tris(hidroximetil)aminometano hidrocloruro (Tris-Cl), pH 7,8 disolviendo 10,34 g de Tris·HCl y 4,17 g de tris(hidroximetil)aminometano (Tris·OH) en 50 mL de agua destilada (dH₂O) en un matraz de 125 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con membrana de 0,2 μm y guárdalo en un tubo cónico a temperatura ambiente.
2. Preparar la solución A (20 mM de cloruro de magnesio (MgCl₂), 0,7 M de sacarosa, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) disolviendo 0,10 g de MgCl₂ (95,2 g/mol) y 11,98 g de sacarosa (342,3 g/mol) en 25 mL de dH₂O en un matraz de 125 mL. Añade 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) y ajusta el volumen a 50 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con membrana de 0,2 μm y guárdalo en un tubo cónico a temperatura ambiente.
3. Prepara la solución B (10 mM MgCl₂, 0,8 M sacarosa, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) disolviendo 0,05 g de MgCl₂ (95,2 g/mol) y 13,69 g de sacarosa (342,3 g/mol) en 25 mL dH₂O en un matraz de 125 mL. Añade 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) y ajusta el volumen a 50 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con membrana de 0,2 μm y guárdalo en un tubo cónico a temperatura ambiente.
4. Preparar 0,8 M de sacarosa disolviendo 13,69 g de sacarosa (342,3 g/mol) en 50 mL dH₂O en un matraz de 125 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con membrana de 0,2 μm y guárdalo en un tubo cónico a temperatura ambiente.
5. Prepara 5 mg/mL de desoxirribonucleasa I (DNasa I) disolviendo 0,015 g de DNasa I en 3 mL de dH₂O en un matraz de 50 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con una membrana de 0,2 μm. Solución alicuota en tubos de microfugas y almacenada a −20 °C.
6. Preparar 0,125 M de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA), pH 8,0, disolviendo 0,698 g de EDTA dissódico dihidratado (372,2 g/mol) en 15 mL dH₂O en un matraz de 125 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con membrana de 0,2 μm y guárdalo en un tubo cónico a temperatura ambiente.
7. Preparar 600 μg/mL de cefalexina disolviendo 0,03 g de cefalexina hidratada (365,404 g/mol) en 50 mL de dH₂O en un matraz de 125 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con una membrana de 0,2 μm y guárdalo en un tubo cónico a 4 °C.
8. Prepara 5 mg/mL de lisozima disolviendo 0,015 g de lisozima en 3 mL de dH₂O en un matraz de 50 mL. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con una membrana de 0,2 μm. Solución alicuota en tubos de microfugas y almacenada a −20 °C.
9. Preparar 3% con tripticasa y caldo de soja (TSB) disolviendo 30 g de TSB en 1 L de dH₂O en un frasco de 2 L. Alicuota, la solución en frascos que contienen 25 mL o 100 mL de TSB para usarse en la preparación de esferoplastos de E. coli o protoplastos de B. megaterium, respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar el medio líquido. El TSB estéril puede almacenarse a temperatura ambiente o a 4 °C.
10. Preparar la solución C (1 M sacarosa, 0,04 M maleato, 0,04 M MgCl₂, pH 6,5) disolviendo 34,23 g de sacarosa (342,3 g/mol), 0,46 g de ácido maléico (116,07 g/mol) y 0,38 g de MgCl₂ (95,21 g/mol) en 100 mL de dH₂O en un matraz de 250 mL. Ajusta el pH a 6,5. Esteriliza filtrando a través de un filtro de jeringuilla de 25 mm con membrana de 0,2 μm y guárdalo en un tubo cónico a temperatura ambiente.

2. Preparación de la cultura nocturna

NOTA: Realizar las secciones 2-3 utilizando técnicas estériles adecuadas. Si se desea, una cepa bacteriana puede contener un plásmido para la resistencia a los antibióticos y así reducir la posible contaminación. Si usas una cepa con resistencia a los antibióticos, añade los antibióticos necesarios en los pasos 2.1 y 3.1–3.2.

1. Prepara un cultivo nocturno seleccionando una sola colonia de bacterias con una punta de pipeta estéril y colocándola en un tubo de cultivo de 14 mL que contiene 2–3 mL de 3% de TSB al 3%. Incubar a 37 °C, agitando durante 16–21 horas.

3. Preparación de esferoplastos Gram negativos de E. coli

1. En un matraz de 250 mL, diluye el cultivo nocturno 1:100 en un volumen de 25 mL de 3% w/v TSB e incuba la solución bacteriana a 37 °C, agitando durante aproximadamente 2,5 horas hasta que la solución alcance una densidad óptica de 0,5–0,8 a 600 nm. Mide la densidad óptica usando un espectrofotómetro.
2. En un matraz de 250 mL, se diluye este cultivo 1:10 en 30 mL de 3% p/v TSB e incuba a 37 °C, agitando durante 2,5 h en presencia de 60 μg/mL de cefalexina (347,4 g/mol) para producir filamentos unicelulares de unos 50–150 μm de longitud, que se observan bajo una ampliación de 1.000X usando un microscopio óptico (Figura 1B).
3. Cosecha los filamentos centrifugando la solución bacteriana a 1.500 x g, 4 °C durante 4 minutos. Haz una decantación y desecha el sobrenadante, reservando la bola.
4. Lava los filamentos añadiendo suavemente 1 mL de sacarosa 0,8 M, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Incuba durante 1 minuto y luego descarta el sobrenadante sin alterar la bola.
5. Añadir 150 μL de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μL de 5 mg/mL de lisozima, 30 μL de 5 mg/mL de DNasa I y 120 μL de 0,125 M EDTA en su orden respectivo al pellet e incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos.
6. Añade 1 mL de solución A gradualmente durante 1 minuto a la solución preparada en 3,5 con una micropipeta, mientras se revuelve suavemente la solución a mano. Incuba la solución durante 4 minutos a temperatura ambiente.
7. Introduce 7 mL de la solución B de 4 °C en dos tubos cónicos de 15 mL. Añade cantidades iguales de la solución preparada en 3,6 a cada uno de estos dos tubos. Centrifuga la solución a 1.500 x g, 4 °C durante 4 minutos.
8. Utilizando una pipeta serológica, retira cuidadosamente todo el sobrenadante excepto 1-2 mL sin alterar el pellet. Resuspende el pellet pipeteando suavemente arriba y abajo usando una micropipeta P1000. Comprueba visualmente la formación de esferoplastos observando la muestra con un aumento de 1.000 veces más con un microscopio óptico (Figura 1C).
9. Guarda los esferoplastos a -20 °C durante hasta una semana o hasta que hayan pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.

Resultados

Figura 1: Imágenes representativas de Escherichia coli. (A) bacterias E. coli , (B) serpientes E. coli y (C) esferoplastos de E. coli. Las imágenes se tomaron con una ampliación ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de Trizma (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma base (Tris OH)	Sigma	T1503
Cloruro de magnesio	Sigma	M8266
Sacarosa	Sigma	S7903
Lisozima	Sigma	L6876
Desoxirribonucleasa I	Sigma	D4527
Ácido etilendediaminético tetraacético	Sigma	106361	Utilizó Sigma 106361 en el desarrollo original del protocolo; 106361 descontinuado con el ED2SS como sustituto
Hidrato de cefalexina	Sigma	C4895
Caldo de soja BBL Trypticase	Fisher Scientific	B11768
Ácido maléico	Sigma	M0375
Filtro de jeringuilla Acrodisc de 25 mm con membrana HT Tuffryn de 0,2 μm	Corporación Pall	4192