Establecimiento de un modelo murino de infección vaginal por Streptococcus del grupo B

Resumen

Fuente: Patras, K. A., Doran, K. S. Un modelo murino de colonización vaginal de Streptococcus del grupo B. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo muestra la preparación e inoculación vaginal de una ratona hembra tratada con hormonas y con estreptococo del grupo B para modelar la infección. Explica cómo cultivar y preparar las bacterias, administrar el inóculo en la luz vaginal y asegurar una infección exitosa.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Inoculación vaginal con estreptococo del grupo B (SGB)

1. Un día antes de la inoculación, cultivar un cultivo líquido de 5 ml durante la noche de una cepa de GBS de interés, como A909 (serotipo Ia), en caldo Todd Hewitt (THB) a 37 °C.
2. Subcultiva el GBS durante la noche a un volumen 1:10 en THB fresco e incuba a 37 °C. Haz crecer la bacteria hasta la fase media logarítmica (ED₆₀₀ = 0,4-0,5).

NOTA: Esto suele tardar entre 2 y 3 horas, dependiendo de la variedad de GBS.

3. Transfiere la subcultura a un tubo cónico estéril de 15 ml y pelleta bacterias a 3.000 × g durante 5 minutos. Aspira el sobrenadante. Resuspende el pellet bacteriano en 200 μl de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
4. Utilizando el pellet resuspendido, lleva entre 3 y 5 ml de PBS (1 ml por cada 10 ratones) a exactamente OD₆₀₀ = 0,4 en un nuevo tubo de cultivo de 5 ml. Esta será una concentración de ~ 1 × 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. Transfiere a un tubo cónico nuevo de 15 ml y vuelve a aplicar la bacteria a 3.000 × g durante 5 minutos. Aspira el sobrenadante.
5. Resuspende el pellet en PBS a 1/10 del volumen original. Por ejemplo, si se han pelleteado 3 ml de OD₆₀₀ = 0,4, resuspenderlo en 300 μl de PBS.

NOTA: Esta es la última suspensión bacteriana (~ 1 × 10⁹ UFC/ml) utilizada para la inoculación animal.

6. Reserva 50 μl de esta suspensión para dilución en serie y placado en agar THB para determinar el inoculo exacto.
7. Inocular a cada ratón con 10 μl de la última suspensión bacteriana para que se administren 1 × 10^{7 UFC} a cada ratón.
   1. Para inocular, sujeta manualmente al ratón asegurando la piel flácida en la nuca del cuello entre el pulgar y el índice del manejador y luego inmovilizando la cola.
   2. Extrae 10 μl del GBS en una punta de pipeta de carga de gel de 200 μl. Inserta la punta de 5 a 10 mm en la luz vaginal y dispensa los 10 μl de inóculo.
      NOTA: Se prefieren las puntas de carga en gel frente a las puntas estándar de 200 μl para minimizar el riesgo de traumatismo o lesión en órganos, especialmente en ratones jóvenes o pequeños.
   3. Inmediatamente después de la inoculación, suelta la nuca del cuello y eleva la parte trasera del ratón, levantando al ratón por la cola y caminando las patas delanteras sobre una superficie dura durante ~ 1 minuto.
   4. Inspecciona visualmente la abertura vaginal para detectar cualquier reflujo de inóculo. Si se observa reflujo, se puede usar una punta nueva de la pipeta para manipular o agrandar la abertura vaginal, facilitando la captación del reflujo hacia la luz. Además, el reflujo puede aspirarse mediante una pipeta y volver a vacunarse.
      NOTA: Si se administran agentes tópicos, organismos probióticos o proteínas de interés, se puede administrar un volumen de hasta 20 μl en un tampón fisiológico en el tracto vaginal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Puntas de pipeta con carga de gel de 200 μl	USA Scientific	1252-0610
Caldo Todd Hewitt	Hardy Diagnostics	7161C
Solución de sal tamponada con fosfato de Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV