Cuantificación de la supresión de biopelículas inducida por enzimas en bacterias patógenas

Resumen

Fuente: Tay, S. B., et al. Disrupción antivirulenta de biopelículas patógenas mediante lactonasas modificadas que apagan el quórum. J. Vis. Exp. (2016)

El vídeo demuestra un método para cuantificar biomasa de biofilm en una bacteria patógena, comparando controles no tratados con muestras tratadas con una enzima que apaga el quorum. La enzima interrumpe la señalización bacteriana durante la incubación temprana, reduciendo la adhesión celular. Tras el lavado y una incubación adicional, los pozos de control forman biopelículas densas, mientras que los pozos tratados muestran una formación reducida. Se utiliza un tinte catiónico para teñir el biofilm y se mide la absorbancia para evaluar la biomasa.

Protocolo

1. Cuantificación violeta cristalina de la formación de biofilm en A. baumannii S1

1. Cultiva un cultivo de 5 mL de Acinetobacter baumannii S1 (A. baumannii) en caldo de lisogénia (LB) (triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L) a 30 °C en una incubadora agitada (220 rpm) durante 16 horas.
2. Ajustar el cultivo de A. baumannii S1 a una densidad óptica deseada a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,8. Utilizando una placa de 96 pozos, inocular el cultivo bacteriano (dilución 1:100) en LB fresco que contenga 10 μl de enzima GKL purificada (40 mg/ml); El volumen final de la nueva cultura es de 100 μl.
3. Prepara también una cultura de control; Esto no contendrá ninguna enzima. Repite condiciones similares para obtener el número deseado de réplicas.
4. Cubre el plato con una tapa y colócalo en un recipiente de plástico sellado de 10 L. Incuba la placa a 30 °C durante 3 horas antes de retirar suavemente el medio.
5. Añade otros 100 μl de medio fresco en LB al pozo y incuba la placa durante 21 horas a 30 °C.
6. Tras el segundo periodo de incubación, retira suavemente todo el material. Lava la célula bacteriana planctónica con agua estéril de 200 μl. Asegúrate de que las células sufran solo una mínima alteración durante el lavado.
7. Añade 100 μl de solución de violeta cristalina al 1% en cada pozo e incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Elimina la solución de violeta cristalina lavando el pozo con agua estéril de 200 μl. Repite el lavado dos veces más.
8. Añadir 100 μl de ácido acético al 33% en cada pozo y incubar durante 15 minutos con suaves agitaciones; Esto disolverá el tinte.
9. Cuantifica la cantidad de biofilm formada midiendo la absorbancia de la violeta cristalina a 600 nm. La cantidad de violeta cristalino es proporcional a la cantidad de biofilm formada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Triptona	BD	211705
Extracto de levadura	BD	212750
Placa de 96 pozos	Compañero de reparto	3596
Violeta Cristalino	Sigma-Aldrich	C6158
Ácido acético	Escaneo de laboratorio	PLA00654X	Precaución: Inflamable
Lector de microplacas Synergy HT	BioTek