1. Microscopía de barrido láser confocal del biofilm S1 de A. baumannii
1. Cultivar un cultivo de 5 ml de A. baumannii S1 en LB a 30 °C en una incubadora agitada (220 rpm) durante 16 horas.
2. Ajustar el cultivo de A. baumannii S1 a un OD deseadode 600 de 0,8. Utilizando un plato μ-D con fondo de vidrio de 35 mm, inocular el cultivo bacteriano (dilución 1:100) en LB fresco que contenga 30 μl de enzima GKL purificada (40 mg/ml); El volumen final de The New Culture es de 1 ml.
3. Cubre el μ-Plate con una tapa y colócalo en un recipiente de plástico sellado de 10 L. Incuba el plato μ a 30 °C durante 3 horas antes de retirar suavemente el medio. Añade 30 μl de enzima GKL purificada y medio fresco, alcanzando un volumen total de 1 ml. Incuba otras 21 horas a 30 °C.
4. Repite el paso 1.3 y incuba el μ-Plato durante otras 24 horas a 30 °C. Luego, retira los medios con cuidado.
5. Añadir 500 μl de aglutinina germinal de trigo (WGA) conjugada Alex Fluo 488 de 5 μg/ml disuelta en la solución salífera balanceada de Hank (HBSS) al μDish e incubar a 37 °C durante 30 minutos; Esto teñirá el biofilm formado. Retira la solución de manchas y lava el plato de μ con 2 ml de HBSS. Repite el paso de lavado una vez más.
6. Añadir 500 μl de formaldehído al 3,7 % disuelto en HBSS e incubar a 37 °C durante 30 minutos; esto fijará la biopelícula en la μ-Dish. Lava el μDish una vez con 2 ml de HBSS y luego elimina completamente la solución. El μ-Dish fijado con biofilm puede almacenarse en la oscuridad a 4 °C antes de la imagen del CLSM.
7. Para la imagen y análisis CLSM, usar una ampliación de 63 veces para generar 97 pilas por imagen con un intervalo de 0,21 μm por pila.
