Detección de sacaribacterias en cultivo binario mediante reacción en cadena de la polimerasa

Resumen

Fuente: Collins, A. J., et al., Estableciendo cultivos binarios estables de sacaribacterias simbióticas a partir de la cavidad oral. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demuestra el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar las Saccharibacterias en un cultivo binario con Actinomyces. El protocolo describe la amplificación del ADN y la electroforesis en gel para confirmar una interacción estable entre huésped y parásito.

Protocolo

1. Confirmar la infección por Saccharibacteria mediante PCR
   1. Tras 5 pasajes, confirmar la infección con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cinco pasajes asegurarán que cualquier célula de Saccharibacteria no en crecimiento haya sido agotada más allá del límite de detección mediante 25 ciclos de PCR.
   2. Prepara una mezcla master PCR. Una receta sugerida es la siguiente: para cada tubo necesario, preparar 12,5 μL de 2x tampón PCR, 0,75 μL 10 μM cebador directo (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM cebador inverso (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl_{2, y 9} μL de agua. Mezcla por vórtice.
   3. Alicuota de 24 μL de mezcla maestra en un tubo PCR de 0,2 mL. Añade 1 μL de cultivo infectado con Saccharibacteria a la reacción PCR. Coloque el tubo en un termociclador y realice el siguiente protocolo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, 25 ciclos a 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s, elongación final a 72 °C durante 2 minutos y luego retención final a 4 °C.
   4. Carga y ejecuta los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Una banda de ~600 bases indicará la presencia de Saccharibacteria.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Caldo de infusión Brain Heart (polvo deshidratado)	Becton-Dickinson	211059	U otro medio de cultivo adecuado para organismos objetivo
Fuente de alimentación por electroforesis	Bio-Rad	1645052
Equipo de electroforesis	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	O termociclador equivalente para PCR
Solución de MgCl₂ 25mM	Promega	A3513
Agua de grado en biología molecular	Fisher Scientific	BP2819100
Micropipeta P-1000	Gilson	F123601G
Tubos PCR 0,2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Puntas de pipeta - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Tinción en gel de ADN segura SYBR	ThermoFisher Scientific	S33102
Caldo de soja tríptico (polvo deshidratado)	Becton-Dickinson	211825	U otro medio de cultivo adecuado para organismos objetivo