Aislamiento de bacterias patógenas intracelulares a partir de células infectadas del huésped

Resumen

Fuente: Sigal, N., et al. Purificación de ARN de Listeria monocytogenes cultivada intracelularmente en células macrófagas. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demuestra el aislamiento de bacterias patógenas internalizadas a partir de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) infectados. Se permite que las bacterias se adhieran a las células huésped y las bacterias no adheridas son arrastradas. Tras la internalización, se añade un antibiótico para eliminar bacterias no internalizadas. Las células hospedadoras se lisan, centrifugan y el sobrenadante se filtra para capturar las bacterias en papel filtrante, que se congela rápidamente y se almacena para su uso posterior.

Protocolo

NOTA: Durante todo el experimento, las células de macrófagos se incuban a 37 °C en una incubadora de aire forzado al 5% de_CO2 y se extraen de la incubadora solo para manipulaciones experimentales, que se realizan en un gabinete de seguridad biológica de Clase II. Trabajar con bacterias Listeria monocytogenes está de acuerdo con las normativas de seguridad biológica nivel 2.

1. Preparación celular e infección bacteriana (Días 1 y 2)

1. Día 1
   1. Sembra 2,0 x 10⁷ células macrófagas derivadas de la médula ósea (BMDM) en un plato de 145 mm en medio de 30 ml de BMDM + Pen-Strep (Tabla 2). Sembra 3 placas para cada cepa bacteriana que se va a analizar. Incubar durante la noche a 37 °C en una incubadora de aire forzado con 5% de CO₂ .
   2. Inicie un cultivo bacteriano nocturno de la cepa silvestre (WT) de L. monocytogenes 10403S en 10 ml de medio de infusión cerebral cardíaca (BHI), a 30 °C en una incubadora estándar. Coloca los tubos de cultivo inclinados sin vibrar.
      NOTA: Estas condiciones de crecimiento regulan al alza la expresión de los genes de los flagelos, lo que favorece una infección eficiente.
2. Día 2
   1. Medio BMDM precalentado (sin antibióticos Pen-Strep) (Tabla 2) y suero salino tamponado con fosfato (PBS) a 37 °C.
   2. Lava la monocapa de macrófagos dos veces con 25 ml de PBS precalentado para eliminar los antibióticos. Añade 30 ml de medium BMDM fresco.
   3. Lava 1,5 ml de cultivo bacteriano durante la noche con PBS centrifugando las bacterias a > 14.000 x g durante 1 minuto, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo suavemente las bacterias en 1,5 ml de PBS mediante pipeteo. Repite dos veces.
   4. Infectar cada placa de macrófagos con 0,5 ml de un cultivo nocturno lavado de L. monocytogenes tipo salvaje. Si usas varias placas, infecta cada placa con 15 minutos de diferencia. Este intervalo permitirá extraer cada placa individualmente al final de la infección.
      NOTA: La multiplicidad de la infección (MOI) se analiza mediante el placado de diluciones en serie de cultivo bacteriano utilizado para la infección en placas de agar BHI y el conteo de unidades formadoras de colonias (CFU) tras una incubación de 24 horas de placas a 37 °C. Usando 0,5 ml de WT L. monocytogenes de la cepa 10403S se obtiene un MOI de ~ 100 (100 UFC bacterianas por célula de macrófagos). Al analizar mutantes bacterianos defectuosos en el crecimiento intracelular, debe considerarse un MOI más alto.
   5. Tras una incubación de 0,5 horas a 37 °C, lava las células infectadas dos veces con PBS para eliminar bacterias no adheridas y añade 30 ml de medio BMDM precalentado. Las bacterias adheridas se internalizarán durante las siguientes 0,5 horas.
   6. A la hora de la infección, añadir 30 μl de gentamicina (1:1.000 para alcanzar una concentración final de 50 μg/ml) para eliminar bacterias extracelulares.
   7. Monta el aparato filtrante colocando una cabeza filtrante sobre un matraz de líquido colector con un puerto de salida al vacío. Luego coloca un filtro (0,45 μm) sobre una cabeza filtrante, seguido de un embudo cilíndrico, y asegura las diferentes piezas con una abrazadera metálica. Prepara agua helada y libre de RNasa.
   8. A las 6 horas de la infección, recolecta bacterias de las células infectadas de la siguiente manera. Trata cada plato individualmente.
      NOTA: Normalmente, L. monocytogenes completa 1-log de crecimiento durante 6 horas de infección en las células de macrófagos. Incubaciones más largas podrían provocar un sobrecrecimiento bacteriano y la muerte celular de los macrófagos, mientras que periodos de incubación más cortos podrían resultar en cargas bacterianas considerablemente menores. El MOI y el momento de la infección pueden modificarse para alcanzar condiciones óptimas.
      1. Lava las células infectadas con PBS una vez. Añade 20 ml de agua sin RNasa helada para lisar las células de los macrófagos. Usando un raspador de celdas, raspa las celdas de la placa rápida pero con cuidado.
      2. Recoge las células lisadas en un tubo cónico de 50 ml. Vórtice durante 30 segundos. Centrifuga a 800 x g durante 3 minutos a 4 °C.
      3. Pasar el sobrenadante a través del aparato de filtración mediante un sistema de vacío. Con pinzas, enrolla el filtro y transfiere rápidamente a un tubo cónico de 15 ml. Congela los tubos con los filtros en nitrógeno líquido.
      4. Montar el aparato de filtración con un nuevo filtro para la siguiente muestra, como se describe en la 1.2.7.
      5. Guarda los filtros congelados a -80 °C durante el día siguiente. Alternativamente, procede directamente a la extracción de ácidos nucleicos.

Tabla 1: Protocolo de reacción DNasa.

ARN	hasta 2 μg (en volumen máximo de 44 μl)
Búfer DNasa 10x	5 μl
Agua libre de RNasa	Completo hasta 50 μL de volumen total
DNAse	1 μl (1 unidad)

Tabla 2: Recetas de medios y buffers.

1. 500 ml de medios BMDM+Pen-Strep (esterilizados con filtro):
Eagle Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco	235 ml
Suero fetal bovino (FBS) (inactivado 30 min a 54 °C)	100 ml
Factor estimulante de colonias de macrófagos o M-CSF (medio condicionado L-929)	150 ml
Glutamina	5 ml
Piruvato de sodio	5 ml
β-Mercaptoetanol	0,5 ml
Penicilina/Estreptomicina	5 ml
Total	500 ml
2. 500 ml BMDM (esterilizado por filtro):
DMEM	235 ml
FBS (inactivado 30 min a 54 °C)	100 ml
M-CSF (L-929 medio acondicionado)	150 ml
Glutamina	5 ml
Piruvato de sodio	5 ml
β-Mercaptoetanol	0,5 ml
Total	500 ml
3. Búfer AE
Acetato de sodio (NaOAc) pH 5,2	50 mM
Ácido etilendediaminático tetraacético (EDTA)	10 mM
Agua libre de RNasa
4. fenol-cloroformo-IAA
Fenol	25 ml
Cloroformo	24 ml
Alcohol iso-amílico	1 ml
5. cloroformo-IAA
Cloroformo	24 ml
Alcohol iso-amílico	1 ml

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Listeria monocytogenes 10403S
Macrófagos derivados de médula ósea preparados a partir de ratones hembras C57B/6
H₂O, ARNAsa libre	Termo Científica	10977-015	Se puede utilizar agua tratada con DEPC
DMEM	Gibco	41965039
Glutamina	Gibco	25030081
Piruvato de sodio	Gibco	11360-088
β-Mercaptoetanol	Gibco	31350010
Pen/Estreptococo	Gibco	15140-122
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Infusión cerebral y corazón (IBH)	Merckmillipore	1104930500
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Absoluto del etanol	Merck Millipore	1070174000
Incubadora de aire forzado de 37 °C, 5% de CO₂	Termo Científica	Modelo 3111
Raspadores de celda	Nunc	179693
Soporte para cristales Kontes para filtros de 45 mm	Fisher	K953755-0045
Filtros MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Sistema SpeedVac	Termo Científica	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Industrias científicas	Modelo G560E
Platos de cultivo celular de 145 mm	Greiner	639 160
Tubos de 1,7 ml, sin RNasa	Axygen	MCT-175-C
Centrífuga de mesa de 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipetas estériles, 25 ml	Greiner
Tubos Falcon, 50 ml	Greiner