Extracción de ARN de Listeria monocytogenes obtenida de macrófagos murinos infectados

Resumen

Fuente: Sigal, N., et al. Purificación de ARN de Listeria monocytogenes cultivada intracelularmente en células macrófagas. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra la extracción de ARN de Listeria monocytogenes aislada de macrófagos murinos infectados. El protocolo preserva el ARN, lisa las células usando fenol-cloroformo y calor, y separa el ARN mediante centrifugación. La sal y el etanol, combinados con la incubación en frío, promueven la precipitación de ARN. El ARN resultante captura la expresión génica inducida por el huésped, revelando la virulencia bacteriana y las estrategias de adaptación.

Protocolo

1. Extracción de ácidos nucleicos

NOTA: Realiza todas las manipulaciones con soluciones de fenol y cloroformo en una campana extractora.

1. Prepara una mezcla 1:1 de fenol acidificado: cloroformo, 400 μl por muestra. Mezclar en tubos separados y luego extraer la capa acuosa resultante por aspiración. Añade 40 μl de SDS al 10%.
2. Descongela los tubos que contienen el filtro sobre hielo para mantenerlos fríos. A cada tubo que contenga el filtro añade 650 μl de tampón acetato-EDTA (AE) (50 mM NaOAc pH 5,2, 10 mM EDTA, agua sin RNasa).
3. Realiza los siguientes pasos lo antes posible.
   1. Haz un vórtice vigoroso en el tubo que contiene el filtro para que este se mueva hacia la periferia del tubo y el buffer lave completamente el filtro. Mantén siempre el tubo frío volviéndolo a poner sobre hielo.
      NOTA: Puede ser necesario hacer un vórtice adicional en el tubo invertido para limpiar completamente las bacterias del filtro.
   2. Repite para todos los tubos. Puede ser útil desacelerar la suspensión brevemente (1 minuto a 120 x g) al final del proceso.
4. Transfiere el tampón que contiene bacterias a un tubo microcentrífuga de 1,5 ml que contiene la mezcla SDS y fenol/cloroformo. Repite para todos los tubos. Puede ser necesario girar de nuevo los tubos que contienen el filtro (1 minuto a 120 x g) para obtener el tampón residual del filtro.
5. Coloca todos los tubos de 1,5 ml en un dispositivo de vórtice de varios tubos y usa el vórtice a máxima velocidad durante 10 minutos.
6. Incuba los tubos en un bloque de calor a 65 °C durante 10 minutos. Centrifugar a máxima velocidad (> 14.000 x g) durante 5 minutos.
7. Transfiere la capa acuosa (unos 400 μl) de cada tubo a un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 40 μl de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 1,0 ml de etanol al 100%. Revisa bien cada tubo con el vórtice.
   NOTA: En este paso se puede añadir glucógeno para mejorar la visualización del pellet precipitado.
8. Incuba las muestras a -80 °C durante 1 hora. Alternativamente, incubar muestras a -20 °C durante la noche. Luego, centrifugar las muestras a 4 °C durante 20 minutos a máxima velocidad (> 14.000 x g).
9. Aspira cuidadosamente el etanol (capa superior) de cada tubo. Añade 500 μl de etanol frío al 70% a cada muestra y haz un vórtice completo. Centrifugar a 4 °C durante 20 minutos a máxima velocidad (> 14.000 x g).
10. Aspira cuidadosamente el etanol de cada tubo. Seca las muestras durante aproximadamente 2 minutos usando un evaporador de vacío sin calor. No seques demasiado las muestras.
11. Añade 25 μl de agua libre de RNasa a cada muestra. Incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Con cuidado, vórtice y giro hacia abajo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Listeria monocytogenes 10403S
H2O, libre de ARN	Termo Científica	10977-015	Se puede utilizar agua tratada con DEPC
pH saturado en fenóles 4,3	Fisher	BP1751I-400
Cloroformo	Fisher	BP1145-1
Alcohol iso-amílico	Sigma-Aldrich	W205702
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Absoluto del etanol	Merck Millipore	1070174000
Filtros MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Genie 2	Industrias científicas	Modelo G560E
Bloque de calor de 65 °C	Termo Científica
Centrífuga de mesa de 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipetas estériles, 25 ml	Greiner
Tubos Falcon, 50 ml	Greiner
Tubos de 1,7 ml, sin RNasa	Axygen	MCT-175-C
Sistema SpeedVac	Termo Científica	SPD131DDA