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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
1. Preparación de inóculo bacteriano de Escherichia coli (UPEC) uropatógeno
- Prepara infecciones urinarias89 (UTI89) (inicia 72 horas antes del día de la inoculación)
- Estirar UTI89 sobre una placa de agar LB (Luria-Bertani) desde una culata congelada. Incuba durante la noche a 37 °C. Elige una colonia e inocúlala en 10 ml de LB en un matraz de 125 ml. Incuba a 37 °C durante 24 horas, de forma estática.
- Inocular 10 μl de cultivo nocturno en 10 ml de LB en un nuevo matraz de 125 ml durante 24 horas adicionales a 37 °C, de forma estática.
- Transfiere 3 ml (varía según la cepa y el tamaño del inoculo deseado) a tubos estériles de 1,5 ml y centrifuga a 7.000 x g durante 3 minutos, resuspende el pellet en 1 suero salino tamponado con fosfato (PBS) y centrifuga una segunda vez. Resuspende el pellet bacteriano en 1 mL de PBS 1.
- Mide la densidad óptica bacteriana y ajusta la concentración a la densidad del inóculo deseada. La concentración estándar del inóculo utilizado es de10,7 bacterias; sin embargo, esto puede variar debido al diseño del estudio.
2. Inoculación bacteriana
- Limpia la estación de trabajo con etanol al 70% y cubre la zona con papel absorbente (o usa una campana de flujo estéril).
- Extrae hasta 0,9 ml del inóculo bacteriano preparado en una jeringuilla de 1 ml de tuberculina (TB) (elimina las burbujas de aire). Coloca una aguja de inoculación estéril preparada con polietileno con un tamaño designado de 10 (PE10) tubo en la jeringuilla que contiene el inóculo, y luego recorta estérilmente el tubo de polietileno.
NOTA: Deja 1 mm de tubo por encima de la punta de la aguja para evitar perforar la vejiga. - Corta un trozo de parafilm de 1 pulgada cuadrada y pon una pizca de lubricante quirúrgico (aproximadamente del tamaño de una moneda de diez centavos) encima.
- Anestesiar a las ratones C3H/HeN hembras colocándolas en una cámara de vaporizador (siguiendo el protocolo del fabricante) hasta que estén inconscientes pero respirando normalmente (1 respiración/segundo).
PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico inhalable. Úsalo en un lugar bien ventilado y minimiza la inhalación. - Saca el ratón del vaporizador y colócalo boca arriba sobre una toalla de papel y abre las patas.
- Cubre la nariz del ratón con un cono nasal (un tubo conectado al vaporizador que proporciona una dosis controlada de isoflurano que viene equipada en algunos vaporizadores) para mantener la anestesia.
- Palpa suavemente la vejiga para inducir la micción y asegurar que la vejiga esté vaciada. Limpia la zona periuretral con una toallita 100% etanol. Aplica primero la aguja/jeringuilla de inoculación, apuntando primero, en el lubricante quirúrgico.
- Inocular a cada ratón con 50 μl de la solución bacteriana insertando la aguja de inoculación transuretralmente, aproximadamente 12 mm, y presionando suavemente el émbolo de la jeringuilla para dispensar el inóculo en la vejiga (10 μl/seg). Retira la aguja de inoculación del ratón.
NOTA: El retorno inmediato del inóculo en la abertura uretral al comenzar a inocular indica una inserción incorrecta o incompleta de la aguja. - Retira el ratón del cono de la nariz y devuélvelo a su jaula. Repite los pasos 2.3-2.8 para cada ratón. Cuando/si se cambia de condición o cepa del inoculo, desecha la jeringuilla y la aguja de inoculación en un recipiente aprobado para punzantes y comienza de nuevo en el paso 2.2.
NOTA: La inoculación con organismos uropatógenos generalmente no causa síntomas de dolor severos. Sin embargo, en casos raros, administrar dosis elevadas de patógenos puede causar fiebre, reducción en la ingesta de alimentos y agua, y comportamientos anormales. La salud animal debe ser monitorizada durante todo el experimento. Si se detectan síntomas de dolor evidentes, se puede aplicar un analgésico, como la buprenorfina (0,05−0,1 mg/kg administrada por vía subcutánea).
3. Enumeración de comunidades bacterianas intracelulares (IBC)
- Retira la vejiga asépticamente y colócala en una placa de 6 pozos con fondo de silicona. Las placas pueden prepararse utilizando un kit de elastómeros de silicona y verter aproximadamente 1 cm de silicona en cada pozo. Corta la vejiga por la mitad con unas tijeras.
- Usando pequeños pasadores metálicos, extiende suavemente la vejiga para que el lumen de la vejiga quede hacia arriba. Asegúrate de colocar los pasadores en los bordes más externos de las secciones de la vejiga para que quede expuesta la máxima cantidad de urotelio.
- Después de esparcir, lava suavemente la vejiga una vez con 1x PBS. Quita el PBS 1x con pipeta. Arregla la vejiga añadiendo suficiente 3% de paraformaldehído para cubrir toda la vejiga abierta.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es cancerígeno. Se debe llevar siempre el equipo de protección adecuado, incluidos guantes. La eliminación debe seguir las directrices institucionales. - Incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Quita la solución de paraformaldehído. Lava una vez con 1x PBS.
- Lava con la solución de LacZ (2 mM deMgCl 2, desoxicolato de sodio al 0,01% y 0,02% nonidet-p40 en 1x PBS) tres veces durante 5 minutos por lavado.
- Retira la solución de lavado y añade suficiente tinte de LacZ (9,5 ml de solución de lavado de LacZ, 0,4 ml de 25 mg/ml de galón X y 0,1 ml de 100 mM de K-ferrocianuro/K-ferricianuro) para cubrir las vejigas. Incubar a 30 °C durante la noche protegido de la luz.
- Retira las vejigas abiertas de la incubadora y observa los IBC, que aparecen como puntos azules visualizados con un microscopio de disección, ampliación de 40-60X.
NOTA: A veces un ratón puede orinar antes de colocar la trompa bajo la uretra. En este caso, espera 15-20 minutos antes de intentar recoger orina de nuevo.