Establecimiento de un modelo murino de infecciones por quemaduras con bacterias patógenas

Resumen

Fuente: Wang, Y., et al. In Vivo Investigación de la terapia antimicrobiana de luz azul para infecciones por quemaduras multirresistentes a Acinetobacter baumannii mediante imágenes de bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra cómo establecer una infección por quemaduras en un modelo murino aplicando un bloque de latón calentado seguido de un inoculo bacteriano patógeno. Las bacterias colonizan la matriz extracelular expuesta y forman un biofilm, lo que permite estudios in vivo de las interacciones huésped-patógeno.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Modelo murino de infección por quemaduras causada por Acinetobacter baumannii bioluminiscente

1. Utiliza ratones BALB/c hembras adultas de 7-8 semanas y con un peso de 17-19 g. Permite que los ratones se aclimaten a las condiciones de laboratorio durante al menos 3 días antes del inicio del experimento. Mantén a los ratones en un ciclo de 12 horas claro/oscuro a una temperatura ambiente de 21 °C y dales comida y agua al volo.
2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina y xilazina (100 mg/kg-20 mg/kg). Tocar ligeramente la palpebra de cada ratón con un hisopo de algodón; La ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad anestésica adecuada. Cubre los ojos del ratón con pomada veterinaria para evitar que se resequen durante la anestesia.
3. Afeita los ratones de la parte trasera para exponer la mayor cantidad de piel posible usando una máquina de cortar pelo de 50 cuchillas.
4. Coloca la tapa de una placa de Petri de 35 mm bajo el abdomen de cada ratón para mantener su espalda relativamente horizontal.
5. Hierva agua en un vaso de precipitados de 250 mL (80% lleno) usando una placa caliente de corriente alterna (VAC) de 10" x 10" y 220 voltios. Sumerge un bloque de latón (sección transversal de 1 cm x 1 cm) en el vaso hasta alcanzar el equilibrio térmico con el agua. El equilibrio térmico suele tardar <5 minutos y se indica con la reebullición del agua en el vaso.
6. Antes de causar la quemadura, administrar analgésicos preventivos (una inyección subcutánea de 0,1 mg/kg de buprenorfina) para aliviar el dolor.
7. Diez minutos después de los analgésicos preventivos, presiona suavemente el bloque de latón calentado sobre la zona afeitada en la espalda de los ratones durante 7 segundos para inducir quemaduras.
   NOTA: Para evitar lesiones térmicas en el personal trabajador, usa guantes resistentes al calor al realizar el procedimiento de combustión.
8. Administrar 0,5 mL de solución salina estéril mediante inyección subcutánea para evitar la deshidratación.
9. Cinco minutos después de inducir la lesión térmica, se inoculan 50 μL de suspensión bacteriana que contiene 5 unidades formadoras de colonias (UFC) de 10⁶ en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre las quemaduras del ratón usando una pipeta. Luego, usando un hisopo de algodón estéril en zigzag sobre la piel, unta las alicuotas sobre las quemaduras para distribuir las células bacterianas en la zona quemada de la forma más uniforme posible.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mouse	Laboratorios Charles River, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 semanas de edad, 17-19 g de peso
Acinetobacter baumannii	Centro Médico Militar Brooke, Fort Sam Houston, TX	Aislado clínico	Deformación luminiscente diseñada
Jeringuillas de insulina	Fisher Scientific	14-826-79	Jeringuillas de insulina BD Lo-Dose U-100 para inyección
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	721016	0,9% de cloruro de sodio
Suero tamponado con fosfato, solución 1x	Fisher Scientific	BP24384	Un tampón estándar de fosfato utilizado en muchos procedimientos biomoleculares
Bucles inoculantes	Fisher Scientific	22-363-605	Para esparcir inoclum bacteriano en la superficie de quemadura de ratones
Bloque de latón	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm por 10 mm	Para la creación de quemaduras en ratones
Guantes Extreme Dragon PBI/Kevlar de alta temperatura	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	Guantes resistentes al calor
Platos Greiner	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Placa eléctrica digital Corning	Compañía de Instrumentos Cole-Parmer, LLC	UX-84301-65	10" x 10", 220 VAC, para agua hirviendo
Camilla quirúrgica calentada con agua de línea fina para ratón/rata	Sistemas E-Z	EZ-211	Previene la pérdida de calor e hipotermia durante la cirugía
Pomada veterinaria	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	Pomada oftálmica para prevenir la sequedad ocular