Imagen bioluminiscente de heridas por quemaduras infectadas por Acinetobacter baumannii en ratones

Resumen

Fuente: Wang, Y., et al. In Vivo Investigación de la terapia antimicrobiana de luz azul para infecciones por quemaduras multirresistentes a Acinetobacter baumannii mediante imágenes de bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo muestra el procedimiento para obtener imágenes de infecciones de quemaduras en ratones inoculados con Acinetobacter baumannii que portan un operón bioluminiscente. Demuestra cómo la oxidación del sustrato catalizada por luciferasa produce luz proporcional a la carga bacteriana, permitiendo el seguimiento en tiempo real de la progresión de la infección mediante un sistema de imagen bioluminiscencia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Imagen por bioluminiscencia de infecciones en ratones

1. Fotografía los ratones usando un sistema de imagen de baja luz que incluye una cámara de dispositivo acoplado con carga intensificada, un controlador de cámara, una cámara de muestras y un procesador de imagen.
2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina y xilazina (100 mg/kg - 20 mg/kg). Tocar ligeramente el palpebral de los ratones con un hisopo de algodón; La ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad anestésica adecuada.
3. Inicia el software de imagen en vivo. En el panel de control que aparece, haz clic en Inicializar. Espera hasta que el color de la caja de temperatura se vuelva verde, indicando que la temperatura de la etapa en la cámara de la muestra ha alcanzado los 37 °C.
4. Colocar los ratones en el escenario (37 °C) en la cámara de muestras del sistema de imagen, con las quemaduras infectadas directamente bajo la cámara.
   NOTA: La bioluminiscencia de las bacterias podría disminuir cuando las quemaduras se secan. Por ello, se recomienda hidratar las quemaduras del ratón con PBS antes de la imagen.
5. En el panel de control, pon una marca de verificación junto a "Luminiscencia". Selecciona "Exposición automática" para que el tiempo de exposición para la imagen en vivo se optimice con el software de imagen en vivo según la intensidad de la bioluminiscencia.
6. Selecciona "C" en la lista desplegable "Campo de visión". Selecciona la opción "Escanear rango medio" para que el software determine la distancia focal. Pon una marca de verificación junto a Overlay.
7. Haz clic en "Adquirir" para capturar la imagen. En la casilla "Editar etiqueta de imagen", haz clic en "OK"; aparecerán una "Ventana de imagen" y una "Paleta de peaje".
8. Establece parámetros de ROI automático para la selección automática.
9. Cuantifiquen la intensidad de la bioluminiscencia como unidades relativas de luminiscencia (RLUs) y muestren la bioluminiscencia en una escala de falso color que va desde el rosa (más intenso) hasta el azul (menos intenso).
10. Calcular la fracción de supervivencia de las bacterias en quemaduras de ratón en distintos momentos según el análisis de intensidad de bioluminiscencia. La fracción de supervivencia de las bacterias en un momento dado = la intensidad de bioluminiscencia medida en ese momento / la intensidad de bioluminiscencia medida justo antes de la exposición a la luz azul antimicrobiana.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Serie III	Imagen preclínica in vivo
LED de diodo emisor de luz	VieLight Inc, Toronto, Canadá	415 millas náuticas	Fuente de luz para iluminación
Mouse	Laboratorios Charles River, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 semanas de edad, 17-19 g de peso
Acinetobacter baumannii	Centro Médico Militar Brooke, Fort Sam Houston, TX	Aislado clínico	Deformación luminiscente diseñada
Platos Greiner	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm