Administración mediada por agrobacterias de clones virales recombinantes en plántulas de maíz para silenciamiento génico

Resumen

Fuente: Beernink, B. M. et al. Agroinoculación directa de plántulas de maíz mediante inyección con clones infecciosos del virus recombinante del mosaico de la cola de zorro y del virus del mosaico de la caña de azúcar. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demuestra la administración mediada por Agrobacterium de clones virales recombinantes en plántulas de maíz para el silenciamiento génico. Describe el proceso de infección por Agrobacterium , la propagación sistémica del virus y los cambios fenotípicos impulsados por la interferencia del ARN.

Protocolo

1. Inyección
NOTA: Las plántulas de maíz de entre 4 y 7 días de edad pueden usarse para inyección. La tasa de crecimiento de las plántulas se ve muy afectada por las condiciones de crecimiento, la cantidad de radiación fotosintéticamente activa (PAR) (es decir, mayor PAR en el invernadero que en la cámara de crecimiento) y el genotipo, entre otras cosas que pueden ser difíciles de controlar en condiciones de invernadero. Las plantas pueden ser inyectadas tan jóvenes como a los 4 días de edad, cuando miden 2-3 cm de altura sin hojas expandidas, y hasta 7 días cuando la hoja más baja de punta redondeada está expandida. La tasa de éxito de este método de inoculación disminuye rápidamente a medida que las plantas envejecen más allá de los 7 días tras la siembra. El lugar de inyección es el mismo independientemente de la edad de las plántulas.

1. Usando gafas de seguridad, inyecta la suspensión bacteriana en las plántulas a 2-3 mm por encima del nodo coleoptilar usando una aguja de 25G x 5/8" unida a una jeringuilla desechable de 1 mL.
   NOTA: El nodo coleoptilar es donde finalmente se formarán las raíces de la corona. Este es el nodo más bajo de la planta. Normalmente, habrá un cambio de color de verde a blanco en y por debajo del nodo. El lugar de inyección está justo encima del meristem. Diseccionar algunas plántulas en esta etapa puede ayudar a visualizar la ubicación del meristemo y, en consecuencia, el lugar adecuado de inyección.
2. Aplica una presión suave sobre la jeringuilla hasta que la suspensión llene el coleóptil o sea visible en el torciglio, dependiendo de la etapa de crecimiento de las plantas. Esto equivale aproximadamente a 100-200 μL de suspensión.
   NOTA: Si es difícil inyectar la suspensión en la plántula, el lugar de inyección puede estar demasiado bajo. Basta con una presión moderada para inyectar la suspensión.
3. Inyecta todas las plántulas, cambiando jeringuillas y agujas para cada construcción.

2. Cuidado continuo de las plantas

1. Trasplanta las plántulas inyectadas a macetas de 13 x 13 x 15 cm o más grandes cuando tengan 7-8 días.
2. Mantener las condiciones de crecimiento (fotoperiodo de 16 horas y fertilización una vez por semana).

3. Confirmación de la infección (fenotípicamente)

1. Las plantas con puntuación fenotípica se encuentran entre 14 y 21 días después de la inoculación (DPI). Las lesiones derivadas del silenciamiento de la lesión de los genes de control mimítica 22 o fitoeno desaturasa pueden observarse fácilmente en las hojas y son distintas de los síntomas de FoMV.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringuillas de 1 mL	Fisher Scientific	14955450	alternativamente, BD 309659
Cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101			Lleva plásmidos de vir que codifican maquinaria de transferencia de T-ADN, RifR, GmR, de material de laboratorio
Fertilizante			Concentrado de fertilizante Peters 15-15-15
Ollas grandes	Kordlok	SQL0550	5x5x4" o más. Para trasplantar plántulas.
Semilla de maíz dulce Golden Bantam de maíz	Prados americanos, semillas de la Costa Oeste
Sustrato del suelo	Horticultura SunGro	SS#1-F1P	Mezcla para soleros #1/Fafard-1P, cualquier mezcla de suelo en la que el maíz crezca bien es suficiente