Establecimiento de biopelículas bacteriana-fúngica cruzadas para el estudio de la patogénesis oral

Resumen

Fuente: Schlafer, S, y Frost Kristensen, M. Monitorización del pH extracelular en biofilms inter-reino mediante microscopía confocal. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demuestra el cultivo de biopelículas cruzadas de Streptococcus mutans y Candida albicans bajo condiciones similares a las orales para modelar las interacciones bacteriana-fúngica, permitiendo el estudio de la sinergia microbiana, la adhesión mediada por glucano y la virulencia acidogénica en la patogénesis oral.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recogida de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Cultivo de biopelículas inter-reinos

1. Cultivar Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 y Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 en placas de agar sanguíneo a 37 °C bajo condiciones aeróbicas.
2. Transfiere las colonias individuales de cada organismo a tubos de ensayo llenos de 5 mL de infusión cerebral y corazón (BHI). Cultiva durante 18 horas en condiciones aeróbicas a 37 °C.
3. Centrifuga los cultivos nocturnos a 1.200 x g durante 5 minutos. Descarta el sobrenadante, resuspende las células en solución salina fisiológica y ajusta el OD_{550 nm} a 0,5 para C. albicans (~10⁷ células/mL) y S. mutans (~10⁸ células/mL). Diluir la suspensión de S. mutans 1:10 con solución fisiológica estéril (~10⁷ células/mL).
4. Pipeta 50 μL de solución salival estéril, en los pozos de una placa óptica inferior de 96 pozos para microscopía. Incubar durante 30 minutos a 37 °C. Lavar los pozos 3 veces con 100 μL de suero fisiológico estéril. Vacía los pozos.
5. Añade 100 μL de suspensión de C. albicans a cada pozo. Incubar a 37 °C durante 90 minutos. Lávate 3 veces con solución fisiológica estéril.
   NOTA: No vacies completamente los pozos durante el lavado. Deja un depósito de 20 μL para evitar fuerzas de corte excesivas.
6. Añadir 100 μL de suero fetal bovino inactivado por calor (inactivado a 56 °C durante 30 minutos) en cada pozo. Incuba a 37 °C durante 2 horas. Lávate 3 veces con solución fisiológica estéril. Vaciar los pozos, dejando un yacimiento de 20 μL.
7. Añade 100 μL de suspensión de S. mutans (preparado en el paso 1.3) a cada pozo. Añade 150 μL de BHI que contenga un 5% de sacarosa. Incubar a 37 °C durante 24 horas o más. Al cultivar biopelículas antiguas, cambia el medio diariamente a BHI fresco. Al final de la fase de crecimiento de biofilm cruzado, lavar 5 veces con solución fisiológica estéril.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de agar con sangre	Instituto de Suero Statens	677
Infusión cerebral y corazón	Oxóide	CM1135
Infusión cerebral y corazón + 5 % sacarosa	Suministros de laboratorio BDH	10274
Candida albicans	Colección Nacional de Hongos Patógenos	NCPF 3179
Suero fetal bovino	Tecnologías de Gibco Life	10270
Centrífuga refrigerada GS-6R	Beckman	N/A
μ-Plate 96 Pozo Negro	Ibidi	89626
Solución fisiológica estéril	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Vis-espectrofotómetro V-3000PC	VWR	N/A