Un dispositivo microfluídico para imágenes en tiempo real y seguimiento de presión durante la formación de biopelículas

Resumen

Fuente: Kurz, D. L., et al. Plataforma microfluídica para estudiar el biobloqueo en medios porosos. J. Vis. Exp. (2022)

El vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para estudiar la formación de biopelículas. Se introduce una suspensión bacteriana en el microcanal, seguida de incubación para permitir el desarrollo de biofilm. Luego se reanuda el flujo y se utiliza la monitorización de la presión junto con la imagen para detectar la formación de biofilm y la obstrucción de los poros a lo largo del tiempo.

Protocolo

1. Preparación de obleas de silicio

1. Diseña las geometrías del canal microfluídico en software de diseño asistido por ordenador (CAD; véase Tabla de Materiales) e imprime la imagen sobre una película transparente para crear la fotomáscara (Figura 1A).
2. Fabrica el molde maestro mediante litografía blanda (en condiciones de sala limpia) siguiendo los pasos siguientes.
   1. Hornea la oblea de silicio a 200 °C durante 2 horas.
   2. Coloque la oblea en el centro de un recubrimiento de spin y vierta fotorresistencia SU8 3050 (véase Tabla de Materiales) sobre la oblea. Spina coat a 1.700 rpm durante 40 s con un tiempo de rampa de 10 s/100 rpm.
      NOTA: Los parámetros del recubrimiento de espín se establecieron para obtener un espesor objetivo de 100 μm para el SU8 3050.
   3. Tras el proceso de centrifugado, se hornea suavemente la oblea de silicio a 65 °C durante 600 s y 95 °C durante 2.700 s. Deja que la oblea se enfríe a temperatura ambiente durante la noche.
      NOTA: El enfriamiento nocturno mejora la adhesión del SU8 a la oblea.
   4. Colocar la fotomáscara (paso 1.1) sobre la oblea y exponerla a la luz ultravioleta, con una energía de exposición de 250 mJ/cm² y una longitud de onda de 350 nm.
   5. Después de la exposición, hornea el sustrato expuesto a 65 °C durante 60 s y 95 °C durante 300 s.
   6. Revela la oblea de silicio para obtener el molde maestro sumergiéndola en un vaso de precipitados relleno con revelador mrDev600 (véase Tabla de Materiales). Sacude suavemente el vaso durante 1.800 segundos para eliminar la resistencia sin polimerizar. Luego, lava con salpicaduras rociando isopropanol sobre la oblea de silicio y seca al aire.
   7. Hornea duramente la oblea de silicio a 200 °C durante 1.800 s.
3. Silanizar el molde maestro mediante la deposición de vapor de 20 μL de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) de silano (véase Tabla de Materiales) colocado sobre una lámina de vidrio junto al molde durante 40 minutos en un desecador al vacío, creando una presión manométrica de 100 mbar.

2. Fabricación del dispositivo microfluídico

NOTA: El procedimiento de fabricación descrito aquí es para un dispositivo microfluídico con un canal microfluídico. Sin embargo, el mismo método puede aplicarse para fabricar un dispositivo microfluídico con múltiples canales microfluídicos en paralelo.

1. Mezclar el elastómero con su reticulador en una proporción de 10:1 (véase la Tabla de Materiales) para preparar una mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS). Remueve la mezcla hasta que quede uniformemente mezclada y se vuelva opaca debido a las burbujas de aire cerradas.
2. Desgasifica la mezcla en un desecador de vacío, creando una presión manométrica de 100 mbar hasta que se eliminan las burbujas de aire atrapadas y queda transparente. El tiempo necesario para desgasificar suele ser de 30 minutos.
3. Coloca el molde maestro (paso 1) en un plato de cultivo celular (véase la Tabla de Materiales). Vierte 20 g de la mezcla PDMS sobre el molde maestro para obtener canales con un grosor final de 5 mm.
4. Hornea el molde maestro a 70 °C durante 2 horas.
5. Corta el PDMS curado alrededor del canal microfluídico (a una distancia aproximada de 3 mm) usando una cuchilla, y luego despega el canal microfluídico del PDMS del molde maestro.
6. Para crear la entrada y salida de los canales microfluídicos, perfora los orificios con un punzón de biopsia (diámetro de 1,5 mm) en sus extremos (parte superior de los triángulos, véase la Figura 1A). Haz un agujero adicional en el centro del triángulo de entrada para instalar el sensor de presión más adelante.
7. Lava una lámina de vidrio y el canal microfluídico con una solución de detergente comercial al 1% (ver Tabla de Materiales) durante 5 minutos, luego enjuágalos con agua desionizada. Después, lava el canal microfluídico del PDMS y la lámina de vidrio con isopropanol. Luego, enjuágalos de nuevo con agua desionizada. Seca el canal microfluídico del PDMS y la lámina de vidrio con aire comprimido a 1 bar durante 1 minuto.
   NOTA: La estructura porosa del PDMS debe estar completamente seca para que la unión sea efectiva.
8. Coloque el portaobjetos de vidrio y el canal microfluídico en un limpiador de plasma (véase la Tabla de Materiales) y asegúrese de que las superficies a unir estén orientadas hacia arriba. Enciende el limpiador de plasma y trata el canal microfluídico y el portaobjetos de vidrio con plasma de aire a un flujo de aire de 1 SL/h (litro estándar por hora) durante 1 minuto. Une el canal microfluídico al lavaobjetos de vidrio inmediatamente después de sacarlos del limpiador, poniéndolos en contacto entre sí.
   NOTA: Asegúrate de no tocar las superficies tratadas, ya que esto podría afectar a la adhesión. Al fabricar un dispositivo microfluídico con múltiples canales microfluídicos, expone los canales microfluídicos simultáneamente y únelos en un solo paso.
9. Coloca el dispositivo microfluídico enlazado sobre una placa eléctrica a 80 °C durante al menos 15 minutos.
10. Guarda el dispositivo microfluídico en un plato de cultivo celular limpio hasta que comience el experimento.

3. Preparación de la suspensión bacteriana

1. Cultivar una población de Bacillus subtilis NCIB 3610 durante 20 horas antes del inicio del experimento inoculando directamente 3 mL de medio de cultivo de caldo nutritivo nº 3 (véase Tabla de Materiales) de un stock de glicerol congelado en un tubo de cultivo de 15 mL. Incubar en una incubadora agitada a 30 °C y 200 rpm durante la noche (durante 16 horas).
2. Haz una subcultura a partir del cultivo nocturno 4 horas antes del inicio del experimento añadiendo 3 μL del cultivo nocturno en 3 mL de medio fresco (dilución 1:1.000) en un tubo de cultivo de 15 mL. Incubar la subcultura en una incubadora agitada a 30 °C a 200 rpm durante 3,5-4 horas para obtener una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,1.

4. Experimento de crecimiento de biofilm

1. Encienda la incubadora de caja del microscopio 3 horas antes del experimento para asegurar una temperatura estable de 25 °C. Monta la bomba de jeringuilla y los sensores de presión (véase la Tabla de Materiales).
2. Conecta la tubería de entrada y salida al dispositivo microfluídico. Inserta directamente una aguja (con un diámetro exterior de 0,6 mm) en el tubo de entrada para asegurar la conexión entre el tubo y la jeringuilla.
3. Coloque el dispositivo microfluídico, 30 mL de agua desionizada y 30 mL de medio de cultivo en un desecador al vacío y desgasifice durante al menos 1 hora. Luego, extrae lentamente el medio de cultivo y el agua desionizada en dos jeringuillas separadas de 30 mL.
   NOTA: Este paso es crucial para evitar la formación de burbujas en el canal durante el lavado con el medio de cultivo.
4. Monta el dispositivo microfluídico en el microscopio y coloca el tubo de salida en un contenedor de residuos.
   1. Conecta la jeringuilla llena de agua desionizada al canal microfluídico a través del tubo microfluídico e inyecta el agua lentamente hasta que salga por la salida del sensor de presión. Llena el sensor de presión con agua y enjuaga todas las burbujas del tubo que conecta el canal microfluídico con el sensor de presión. Cierra la salida del sensor de presión con los tornillos dedicados al sensor de presión.
      NOTA: El procedimiento de llenado descrito garantiza que los cambios de presión en la entrada de los canales microfluídicos se registren con precisión. Al realizar un experimento con múltiples canales microfluídicos, conecta cada canal a una jeringuilla separada para asegurar condiciones de flujo iguales en todos los canales.
5. Llena el resto del canal microfluídico con agua desionizada.
6. Coloque un filtro de 1,2 μm (véase Tabla de Materiales) sobre la jeringuilla del medio de cultivo. Luego, retira la jeringa de agua y conecta cuidadosamente la jeringa del medio de cultivo al tubo microfluídico de entrada. Monta la jeringuilla en la bomba y enjuaga el canal con el medio de cultivo a un caudal de 2 mL/h durante 1 hora.
   NOTA: El filtro impide que las células bacterianas entren en la jeringuilla durante la carga. Enjuagar el canal microfluídico con el medio de cultivo eliminará las burbujas restantes en la estructura porosa.
7. Ajusta la bomba de jeringuilla al caudal deseado (aquí 1 mL/h) durante el experimento y ajusta la lectura de presión de los sensores de presión a cero.
   NOTA: Al establecer la lectura inicial de presión a cero, solo se medirá la diferencia de presión causada por el desarrollo de biofilm durante el experimento.
8. Pípete 1 mL del cultivo bacteriano a un OD₆₀₀ de 0,1 en un vial de centrífuga de 1,5 mL. Carga el cultivo bacteriano en el canal microfluídico colocando el tubo de salida en el vial de la centrífuga. Tras esperar 5 minutos para eliminar posibles burbujas de aire de la salida de los tubos, extrae 150 μL de solución bacteriana a un caudal de 1 mL/h, hasta que el canal microfluídico se llene con el cultivo bacteriano.
9. Retira cuidadosamente el filtro de jeringuilla del medio de cultivo y coloca la salida en el contenedor de residuos. Dejar las células bacterianas en condiciones de flujo cero en el canal microfluídico durante 3 horas para permitir su fijación superficial en el medio poroso.
   NOTA: Dejar las células bacterianas en condiciones de flujo cero durante 3 horas se optimizó para la adherencia de la cepa bacteriana utilizada, asegurando al mismo tiempo un cultivo bacteriano bien oxigenado. Otras cepas bacterianas pueden requerir más o menos tiempo.
10. Para iniciar el experimento, inicia el flujo ajustando la bomba de jeringuilla al caudal deseado (aquí 1 mL/h) y comienza la lectura de presión en 1 Hz.
11. Adquirir imágenes de la biopelícula en crecimiento en el intervalo de tiempo deseado, configuración óptica y aumento. ​
    NOTA: En el presente estudio, se adquirieron imágenes a 4x de aumento en modo campo claro en 18 posiciones que abarcan todo el dominio del medio poroso cada 6 minutos durante 24 horas.

Resultados

Figura 1: Diseño de canales microfluídicos y configuración experimental. (A) Fotomáscara de los canales microfluídicos con diferentes tamaños de poros (75 μm, 150 μm y 300 μm) usados como análogos de medios porosos y una v...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de jeringuilla Acrodisc de 25 mm, membrana Versapor de 1,2 μm	Corporación Pall	PN4190	Filtros de 1,2 μm
Jeringuilla BD 10 mL (Luer-Lock)	BD	300912	Utilizado para llenar el canal con agua desionizada
Incubadora de caja	Servicios de Imagen de Vida		solía mantener una temperatura estable durante el experimento de crecimiento de biofilm
Medidor de densidad celular CO8000	Bioonda WPA		Medidor de diámetro exterior
Vial de centrífuga	Eppendorf	30120086	1,5 mL
Base CETONI 120	CETONI GmbH		Bomba de jeringuilla
CorelCAD	CorelDRAW		Software utilizado para diseñar las geometrías de canales microfluídicos
Tubos de cultivo (14 mL, estériles)	Greiner Bio-One		Tubos de cultivo
Horno de secado, VENTI-Line	VWR		Horno para curar el PDMS
Muy práctico	Migros		Solución detergente
Placa calefactadora con control de temperatura	VRW		curar la unión PDMS-vidrio tras el tratamiento con plasma
Innova 42 Inc Shaker (Nuevo Brunswick)	Eppendorf		Incubadora
Isopropanol (> 99,8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Tubería de transferencia Masterflex	Masterflex	HV-06419-05	0,020'' diámetro interior, 0,06'' diámetro exterior
Micro Slides, lisas, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Correderos de vidrio
Sensor de presión microfluídico (1 bar)	Flujo-elfo		Sensores de presión
Perforador de biopsia Miltex, diámetro 1,5 mm	Integra		Perforador para hacer los orificios de entrada y salida del canal microfluídico
desarrollador mrDev600	Microrresistencia
Nikon Eclipse Ti2	Instrumentos Nikon		Microscopio
Caldo nutritivo n°3	Sigma Aldrich
Jeringuilla Omnifix con Luer-Lock	B.Braun		jeringuillas de diferentes volúmenes
Zepto de cámara de plasma	Diener Electronic	ZEPTO-1	se usó para unir plasma el PDMS y el lavaobjetos de vidrio
Limpiadas de precisión (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	para secar la lámina de vidrio
Escala	VWR-CH	611-2605	Usado para pesar la relación elastómero/agente de reticulación
Oblea de silicio (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, módulo de spin SM150	Sawatec
SU8 3050 Fotorresist	Kayakuam
Alineador de mascarilla Süss MA6	Grupo SUSS MicroTec		Usada para alinear la máscara de cromo
Sylgard 184	Dow Corning		kit de elastómeros de silicona; Agente de curación
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Plato de cultivo de tejidos 150	TPP	93150
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctil) silano	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	Utilizado para silanizar la oblea de silicano
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Perfilómetro