$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Inoculación de la bacteria
- Determinar el número de bacterias a inocular con referencia a la medición que se va a utilizar para determinar la adhesión bacteriana y la duración del tiempo de incubación.
- Para estudios microscópicos que impliquen tiempos de incubación inferiores a 1 día, inocular un número relativamente grande de bacterias. Añade una cantidad de cultivo para alcanzar una concentración bacteriana final superior a10,6 bacterias por mL. Para tiempos de incubación más largos, reduce el tamaño del inoculo bacteriano.
- Para estudios en los que se mida la adhesión bacteriana mediante el recuento celular viable, se añade una cantidad de cultivo para alcanzar una concentración bacteriana final de 10-3 a 10,6 bacterias por mL.
- Evita añadir tantas bacterias que su metabolismo cambie el pH o la concentración de oxígeno en el medio de incubación. Mide el pH usando papel de pH o un electrodo. Mide la concentración de ogen usando un electrodo de ojigeno.
- Para plantas cultivadas en arena, inocúla de tres formas posibles.
- Inocúla la semilla con las bacterias antes de plantar, remojándolas durante 1 minuto en una suspensión en agua de unas10,6 bacterias por mL.
- Inocúla la raíz germinando plántulas axénicas. Cuando la raíz de la plántula mida aproximadamente 1 cm de largo, sumergila o coloca toda la plántula en una suspensión de 10,6 bacterias por mL en agua durante 1 minuto.
- Inocúla la arena mezclando las bacterias con la arena antes de plantarla para obtener una concentración final de unas 103 bacterias por mL o regando la plántula con una suspensión de 106 bacterias por mL después de la plantación.
2. Incubación de las bacterias con el material vegetal
- Para la incubación en medio líquido, incubar las bacterias con el material vegetal en agua estéril o sacarosa y sales minerales o medio de cultivo de tejido vegetal (como una dilución 1:10 de la mezcla de sales basales Murashige y Skoog o sales MS).
- Utiliza un recipiente al que las bacterias no se adhieran. Intenta mantener la superficie de la planta cubierta de forma continua, ya sea sumergiéndola o agitándola suavemente. La agitación vigorosa puede impedir la adhesión o incluso eliminar bacterias de la superficie de la planta.
- Observa el material vegetal en el microscopio óptico tras intervalos de tiempo variables para determinar cuándo detener la incubación y realizar mediciones. Un proceso temporal de adhesión suele ser valioso, con muestras tomadas cada 1 a 4 horas o cada día, dependiendo de la velocidad de la interacción.
- Para incubar en arena, aplica las mismas consideraciones descritas para la incubación en medio líquido en el paso 2.1.
3. Medición de la adhesión mediante microscopía
- Realiza mediciones microscópicas con Nomarski o ópticas de contraste de fase para facilitar la visualización de las bacterias en las superficies. Sin embargo, se puede utilizar cualquier microscopio de campo claro con aumento de 20X o superior.
- Utiliza la observación microscópica para determinar si las bacterias están distribuidas aleatoriamente o ubicadas en lugares específicos. Además, comprueba si están enlazados individualmente o en racimos. Busca la presencia de microcolonias que sugieran crecimiento bacteriano o atrapamiento tras adherencia. Comprueba si las bacterias parecen formar una biopelícula en la superficie.
NOTA: Una biopelícula es un gran número de bacterias unidas a la superficie y rodeadas por una matriz extracelular. La estructura puede ser lisa y uniforme o tener una arquitectura más complicada. - Utiliza bacterias marcadas con un marcador fluorescente. Si hay otras bacterias presentes y las de interés se identifican mediante una etiqueta fluorescente como la proteína fluorescente verde (GFP), se utiliza microscopía de fluorescencia para determinar la presencia de las bacterias etiquetadas en grupos de otras bacterias. Para GFP, utiliza un filtro con excitación de 490 nm y emisión de 520 nm.
- Comprueba que la etiqueta fluorescente no afecte negativamente a las bacterias observando la adherencia al material axénico de una mezcla igual de bacterias salvajes y bacterias marcadas de la misma cepa utilizando óptica de Nomarski y de fluorescencia. Si las bacterias fluorescentes y oscuras se mezclan aleatoriamente y están presentes en cantidades iguales, entonces la etiqueta no interfirió con el ensayo.
- Determina el número de bacterias adheridas.
NOTA: Es muy difícil determinar el número de bacterias adheridas en el microscopio. Cuando la unión es a superficies irregulares de plantas, generalmente no es posible obtener una medición cuantitativa. La microscopía electrónica de barrido (no discutida en este artículo) puede utilizarse para realizar este tipo de mediciones.- Cuando las bacterias están unidas a una superficie lisa, como un pelo radicular, cuenta el número de bacterias unidas al borde del pelo radicular por cada mm de longitud del pelo radicular. Ten cuidado de usar pelos radiculares de tamaño y forma similares al comparar medidas.
- Para determinar el tamaño de los objetos en el microscopio, utiliza una lámina comercial con marcas medidas. Observa y fotografía esta diapositiva con los mismos ajustes que se usó para el material experimental y utiliza las imágenes resultantes para determinar el tamaño de los objetos en las fotomicrografías.
- Prepara la muestra para microscopía.
- Lava la muestra. Mueve la muestra a una gota de agua o medio de incubación en una lámina de microscopio y obsérvala directamente.
NOTA: Esto tiene la ventaja de que, si no hubo crecimiento bacteriano ni muerte bacteriana real, es poco probable que haya muchas bacterias libres. Toma la ausencia de bacterias libres como señal de advertencia de que pudo haber muerte bacteriana o unión bacteriana al recipiente en el que se realizó la incubación. El efecto de lavar la muestra se muestra en la Figura 1. - Lava la muestra suavemente con agua o medio de incubación colocándola en un frasco con líquido e invirtiendo el frasco con cuidado. Luego coloca la muestra sobre el portaobjetos del microscopio en líquido fresco para su observación.
- Monta la muestra en líquido usando una capa de cubierta común y una lámina de microscopio.
- Si la muestra es gruesa y podría formar un abultamiento bajo la cubierta, usa una barra de tapa con aplicación de presión. Estas cubiertas tienen un anillo de goma o plástico alrededor del borde de la cubierta. Coloca el líquido y la muestra en el pozo dentro del portaobjetos de la tapa y luego coloca la lámina encima y presiona suavemente para sellar la barbeta de la tapa a la lla. Invierte y examina.
- Alternativamente, utiliza una diapositiva para contar algas y una cobertura de forma similar. Ten en cuenta que las diapositivas con esta profundidad generalmente no pueden examinarse con una lente objetivo de mayor aumento a 20X.
