Formación de gránulos de estrés durante la infección por Shigella de células epiteliales cancerosas

Resumen

Fuente: Vonaesch, P. et. al., Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras un desafío bacteriano en células de mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra la infección de las células epiteliales con la bacteria patógena Shigella flexneri y la respuesta celular del huésped resultante. Las proteínas efectoras bacterianas interrumpen la traducción del huésped, desencadenando la formación de orgánulos sin membrana llamados gránulos de estrés, que reflejan la respuesta adaptativa de la célula ante la infección.

Protocolo

1. Preparación de bacterias y células hospedadoras

1. Transfiere llabides de tapa de vidrio de 12 o 14 mm en placas de 24 o 12 pozos, respectivamente, con pinzas estériles, contando un pozo por condición experimental. Esterilizara estos con tratamiento ultravioleta (UV) en una campana de cultivo de tejidos durante 15 minutos.
   NOTA: Incluye pozos de control para el desafío bacteriano y para la inducción de gránulos de estrés (SG) por estrés exógeno.
2. Para una placa de 24 pozos con cubiertas de 12 mm, siembra 1 x 10 5^{células de} mamíferos (por ejemplo, células HeLa) sobre las cubiertas; Presiona las fundas con una punta de pipeta estéril. Dejar que las células se adhieran durante la noche a 37 °C en una incubadora de cultivo tisular al 5% de CO₂ en un medio de cultivo adecuado para cada tipo celular.
   NOTA: Las células de placas hacen que la confluencia de células esté entre el 40 y el 60% al día siguiente.
   1. Para las células HeLa, incubar en el medio modificado Eagle (DMEM) de Dulbecco con aminoácidos no esenciales (NEAA) y suero fetal de ternero (FCS) descomplementado al 10%. Reduce el FCS calentando durante 30 minutos en un baño maria a 56 °C, revolviendo el sérum una vez después de 15 minutos.
3. Para eliminar bacterias, utiliza una punta de pipeta estéril para extraer una pequeña cantidad de un stock de glicerol bacteriano (20% glicerol) almacenado en un congelador a -80 °C y colócala en un plato etiquetado. Utiliza un anillo estéril para dispersar las bacterias por aproximadamente el 10% de la placa. Usa un lazo estéril nuevo y pásalo por la mancha para formar 3 líneas paralelas, media placa de largo. Cruza estas líneas, cubriendo el resto de la placa. Incubar la placa O/N a 37 °C.
   1. Selecciona una sola colonia bacteriana (por ejemplo, Shigella flexneri) de la placa recién estreada. Evita trabajar con colonias bacterianas mayores de 1 semana.
   2. Para la cepa M90T de S. flexneri , inocular una colonia roja de un agar triptico de soja recién estreado en una placa de agar rojo Congo al 0,1% en 8 mL de caldo de soja tríptico en un tubo de 15 mL; Aprieta la tapa e incuba agitando a 222 rpm O/N a 30 °C. PRECAUCIÓN: No uses colonias blancas grandes ya que han perdido el plásmido de virulencia y no son infecciosas.

2. Desafío bacteriano de las células hospedadoras

1. Prepara bacterias para maximizar el potencial de infección.
   1. Para S. flexneri, subcultiva bacterias añadiendo 150 μL de cultivo de O/N a 8 mL de agar de soja tríptico e incuba el agitado a 222 rpm a 37 °C hasta la fase exponencial tardía (~2 h) para inducir la expresión génica de virulencia y potenciar la infección.
      1. Cuando el cultivo tiene una densidad óptica entre 0,6 y 0,9 (medida a 600 nm), transfiere 1 mL de cultivo a un tubo de 1,5 mL. Bacterias en pellet durante 2 minutos a 8.000 x g y resuspendidas en medio infectado (DMEM con NEAA, sin FCS) a OD₆₀₀ = 1. Así, si el OD₆₀₀ es 0,85, resuspende en 850 μL.
         NOTA: Para S. flexneri, a un diámetro_{exterior 600} = 1, habrá 8 x 10⁸ bacterias por mL cuando se cultive en un medio de 8 mL. Una multiplicidad de infección (MOI) de 20 es adecuada. Para otros patógenos, el número de bacterias por mL en un OD_{de 600} y el MOI adecuado deben determinarse empíricamente.
   2. Para potenciar las interacciones bacteriano-huésped, recubre las bacterias con poli-L-lisina (PLL).
      NOTA: El tratamiento de S. flexneri por PLL no tuvo efecto en la dinámica de la SG. Otros patógenos deben ser evaluados para evaluar su aptitud al tratamiento con LLP.
      1. Para recubrir bacterias con PLL, centrifugar 1 mL de cultivo bacteriano durante 2 minutos a 8.000 x g y luego volver a suspender el pellet en 10 μg/mL de PLL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un diámetro_{de 600} = 1.
      2. Añade la solución bacteriana a un plato pequeño, como un pozo dentro de un plato de 12 pozos, y incuba a RT (~ 20 °C) durante 10 minutos con una agitación suave sobre un agitador de platos.
      3. Pelleta bacterias durante 2 minutos a 8.000 x g, elimina el exceso de PLL. Resuspende el pellet en 1 mL de PBS y repite este paso de lavado dos veces. Tras el lavado final, resuspender en medio infectado a OD₆₀₀ = 1.
         NOTA: Aquí, el medio de infección para S. flexneri es el medio celular hospedante con 20 mM de N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfónico) (HEPES) sin FCS.
2. Prepara las células para el desafío bacteriano.
   1. Retira el medio de las células HeLa de mamíferos usando una bomba de succión. Añadir 500 μL de medio celular RT HeLa para lavar las células, girar, retirar el medio usando una bomba de succión y sustituir por un medio de infección adecuado a temperatura ambiente (RT) de 500 μL (por ejemplo, medio celular hospedador con 20 mM de HEPES sin FCS).
   2. NOTA: Para todos los pasos de lavado, trabaja rápido y procesa solo hasta 4 cubiertas a la vez para evitar que las células se sequen.
3. Challenge preparó células HeLa con bacterias para infectar entre el 20 y el 50% de las células.
   NOTA: Es necesario determinar el momento y el MOI apropiados para cada especie bacteriana. Generalmente, un buen inicio es de 30 minutos a 37 °C con un MOI de 10.
   1. Para S. flexneri, desafía las células HeLa usando uno de los dos métodos (paso 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
      1. Centrifuga bacterias no tratadas con PLL (20 μL de OD₆₀₀ = 1/pozo de placa de 24 pozos en medio de 500 μL) sobre las células durante 10 minutos a 13000 x g.
      2. Añadir bacterias recubiertas de PLL (15 μL de OD₆₀₀ = 1/pozo de placa de 24 pozos en medio de 500 μL) durante 15 minutos en RT para permitir que las bacterias se depositen en las células.
   2. Permite que la infección ocurra colocando las células con bacterias asentadas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 30 minutos.
      NOTA: Para momentos cortos, sincroniza la infección por S. flexneri colocando las placas en un baño maria a 37 °C durante 15 minutos en lugar de en la incubadora de cultivo de tejidos.
4. Detener la infección lavando las células.
   1. Para lavar las células y eliminar el exceso de bacterias, retira el medio con una bomba de succión y añade 1 mL de medio de cultivo HeLa fresco precalentado (37 °C) (DMEM, 10% FCS, NEAA). Revuelve el medio, retira y cambia por un medio nuevo. Repite dos veces y deja un medio fresco en las células.
      1. Para S. flexneri u otras bacterias intracelulares, tras la infección de células HeLa y los lavados, se sustituye el medio por un medio estándar de cultivo tisular que contenga 50 μg/mL de gentamicina para eliminar bacterias extracelulares y prevenir una mayor invasión celular.
         NOTA: No añadas antibióticos al medio para bacterias extracelulares.
5. Incuba bacterias con células durante el tiempo deseado en una incubadora de cultivo de tejidos.
   NOTA: En el caso de S. flexneri, la infección puede durar hasta 6 horas, dependiendo del tipo celular. Para las células HeLa, dejar que la infección continúe durante 1,5 - 2 horas antes de añadir tensiones exógenas para inducir la formación de SG. Para las infecciones por Caco-2, en las que Shigella se propaga de célula a célula, infecta durante 30 minutos a 6 horas antes de añadir el estrés exógeno. Las células pueden fijarse en este punto sin añadir tensiones exógenas para evaluar la formación de SG como resultado de la infección bacteriana.

3. Fijación e análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés

NOTA: Procesa las cubiertas de control y experimental al mismo tiempo para evitar diferencias de tinción que puedan afectar al análisis de imagen en los pasos siguientes. Las muestras de control incluyen no haber infección con ni sin tratamiento inductor de SG, y muestras infectadas con y sin tratamiento inductor de SG.

1. Elimina completamente el medio usando una bomba de succión y fija las muestras añadiendo 0,5 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% de RT en PBS. Incubar durante 30 minutos en tiempo de descanso.
   PRECAUCIÓN: La PFA es perjudicial para el manejador y el medio ambiente. Toma las medidas adecuadas para proteger al manipulador y eliminar los residuos químicos.
   NOTA: Alternativamente, fijar durante 15 minutos y luego reemplazar con metanol preenfriado a -20 °C durante 10 minutos para conservar más localización citoplasmática de los marcadores SG.
2. Retira el PFA con una pipeta y desecha el líquido en un recipiente de residuos adecuado. Lava el abrigo con 1 mL de solución salina tris-buffeada (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM cloruro de sodio, NaCl). Incuba la capa de cubierta durante 2 minutos con un suave agitador de platos durante el lavado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Shigella flexneri			Disponible en varios laboratorios bajo petición
Caldo de soja caseína de triptona (TCS)	BD Biociencias	211825	Medio de crecimiento estándar para Shigella, aplicación - crecimiento bacteriano
Agar TCS	BD Biociencias	236950	Agar de crecimiento estándar para Shigella, aplicación - crecimiento bacteriano
Congo rojo	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Herramienta de discriminación para Shigella que ha perdido el plásmido de virulencia, aplicación - crecimiento bacteriano
Poli-L-Lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Útil para recubrir bacterias y aumentar la infección, aplicación - infección
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	Eliminación selectiva de bacterias extracelulares pero no citosólicas, aplicación - infección
HEPES	Tecnologías de la vida	15630-056	El tampón de pH es útil cuando las células se incuban en RT, aplicación - cultivo celular
Eagle medium modificado (DMEM) de Dulbecco	Tecnologías de la vida	31885	Medio estándar de cultivo para células HeLa, aplicación - cultivo celular
Suero fetal para el ternero (FCS)	Biowest	S1810-100	Suplementación al 5% utilizada para el medio de cultivo celular HeLa, aplicación - cultivo celular
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Tecnologías de la vida	11140	Dilución 1:100 utilizada para el medio de cultivo celular HeLa, aplicación - cultivo celular
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Diluyente de reactivo, aplicación - cultivo celular
Paraformaldehído (PFA)	Escenas de microscopía electrónica	15714	El 4% de PFA se utiliza para la fijación estándar de células, aplicación - fijación
Placa de cultivo celular de 24 pozos	Sigma-Aldrich	CLS3527	Placas estándar de cultivo de tejidos, aplicación - cultivo celular
Cubiertas de cristal de 12 mm	NeuVitro	1001/12	Soporte de cultivo celular para aplicaciones inmunofluorescentes, aplicación - soporte celular
Pinzas	Sigma-Aldrich	81381	Medio de montaje barato y robusto que funciona bien para la mayoría de fluoróforos, aplicación - montaje