Imagen por fluorescencia de la colonización bacteriana en tejido renal de ratón

Resumen

Fuente: Behera, R. K., et al. Un método basado en fluorescencia para estudiar la regulación génica bacteriana en tejidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo muestra un método para preparar tejido renal infectado de ratón, teñir ADN y detectar la expresión génica bacteriana utilizando dos reporteros fluorescentes. El rojo marca todas las bacterias y el verde resalta las células sensibles a la infección.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.

1. Extracción de órganos y procesamiento de tejidos
   1. Eutanasiar a los animales mediante inhalación de CO₂ y luxación cervical como método secundario, y realizar necropsias.
   2. Extrae el riñón (derecho) y otros órganos vitales (corazón, hígado, pulmones, bazo) y transfiere a tubos de polipropileno de 15 mL que contienen un 10% [v/v] de formalina tamponada.
   3. Deja que los órganos se fijen en la oscuridad a temperatura ambiente con suaves agitaciones o rotaciones durante al menos 24 horas, pero no más de 48 horas.
   4. Incrusta los órganos en un medio transparente de congelación de tejidos y almacena los tejidos a -80 °C.
   5. Utilizando un criostato, secciona el tejido en cortes de 10 μm de grosor.
   6. Seca las secciones en un tobogán de cristal cargado y prelimpiado durante 20 minutos en la oscuridad. Aplica un medio de montaje duro con tinte 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y un abrigo de cubierta. Se montan las láminas a temperatura ambiente durante la noche y se transfieren a 4 °C para almacenamiento a largo plazo.
2. Microscopía confocal de escaneo láser y procesamiento de imágenes
   1. Examina las láminas montadas para localizar lesiones utilizando láseres adecuados para el reportero fluorescente que se está utilizando. En este caso, se utilizan las señales de fluorescencia verde (GFP o proteína fluorescente verde), roja (tdTomato) y azul (DAPI).
   2. Adquiere la imagen usando el objetivo adecuado para visualizar las células individuales (por ejemplo, normalmente se usan objetivos de 20x o 40x).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C57Bl/6 ratones	Río Charles	NA
Microscopio láser de barrido confocal	Zeiss	NA
Microtomo criostato	Termo Científica	NA
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Homogeneizador Precellys 24	Laboratorios Bertin	NA
Medio congelante de tejidos transparentes Sub Xero	Mercedes Medical	MER5000
Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Medio de montaje antifade Vectashield con DAPI	Laboratorios Vector	H-1500