Cambios morfológicos de imagen en bacterias mediante microscopía de fluorescencia de células vivas

Resumen

Fuente: Brzozowski, R. S. et al. Microscopía de fluorescencia de células vivas para investigar la localización de proteínas subcelulares y los cambios en la morfología celular en bacterias. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demuestra la microscopía de fluorescencia de células vivas para visualizar cambios morfológicos en tiempo real en bacterias. Describe los pasos implicados en la obtención de imágenes, la adquisición en lapso de tiempo y la deconvolución para obtener imágenes de alta resolución en tiempo real.

Protocolo

1. Imagen

1. El día del experimento, enciende el sistema de microscopio. Inicia el software de imagen (véase Tabla de Materiales) haciendo clic en el icono correspondiente en el escritorio. Inicializa el microscopio haciendo clic en la opción Inicializar microscopio (el botón que aparece con un microscopio) en el cuadro de diálogo de inicio del software. Asegúrese de que el objetivo esté completamente bajado usando el ajuste grueso del microscopio antes de la inicialización.
   NOTA: Tras la inicialización, deberían aparecer tres cuadros de diálogo adicionales además del menú de inicio: resolve3D, recogida de datos y monitor de filtro.
2. Colocar una gota de aceite de 1,517 (índice de refracción) sobre el objetivo de inmersión en aceite de 100x suministrado por el fabricante (Apertura numérica = 1,4, Distancia de trabajo = 0,12 mm; véase Tabla de Materiales).
   NOTA: Es importante elegir el aceite de inmersión adecuado para la temperatura a la que se realiza la imagen.
3. Carga el plato inferior de cristal que contiene la muestra en la carcasa metálica (ataúd) y deslízalo suavemente dentro de la abrazadera del escenario.
4. Usa el mando de ajuste grueso para elevar el objetivo hasta que el aceite toque el fondo de cristal del plato. Usa el ocular y el botón de ajuste fino para enfocar la muestra. Una vez que las celdas estén enfocadas, gira el mando del ocular a modo cámara moviendo el selector situado en la parte frontal del cuerpo del microscopio hacia la izquierda.
5. Comienza el experimento usando el software de imagen. En la ventana de resolve3D , selecciona el icono de diseño/ejecutar experimento representado por un frasco. Debería aparecer un nuevo cuadro de diálogo titulado diseño/ejecución de experimento.
   1. Establece el número de pilas Z y el grosor de la muestra usando la pestaña de diseño y luego de seccionar en el cuadro de diálogo de diseño/ejecutar experimento .
      NOTA: Para los experimentos de la sección de resultados representativos, se utilizaron 17 pilas Z con un intervalo de 200 nm para imágenes fijas y cuatro pilas Z con intervalos de 200 nm para microscopía en lapso de tiempo.
   2. Para medir el grosor de las celdas en la muestra, ajusta manualmente el plano Z de forma incremental usando las flechas arriba y abajo en el cuadro de diálogo resolve3D . Marca dónde las celdas se desenfocan como límites superior e inferior para la adquisición de imágenes. Importa esta información antes de ejecutar el experimento.
   3. Para ayudar a minimizar la fototoxicidad y el fotoblanqueo durante la imagen en lapso de tiempo, se reduce el número de pilas Z y se elige el plano medio de las células para la adquisición de imágenes.
6. Seleccione el conjunto de filtros adecuado para el experimento usando la pestaña de diseño y luego canales en el cuadro de diálogo diseño/ejecución del experimento (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Además, selecciona una referencia para la recopilación de información POL/DIC. Ajusta el porcentaje de transmisión (intensidad de luz) y la duración de la exposición para los canales individuales seleccionados antes de la imagen seleccionando las opciones adecuadas en el cuadro de diálogo resolve3D .
      NOTA: En un campo de visión de prueba que no se considere para el experimento, se prueban estos ajustes para identificar si los parámetros seleccionados obtienen datos de fluorescencia significativos sin perder una señal débil ni sobresaturarla. Luego importa estos parámetros para el montaje experimental.
7. Abre la lista de puntos seleccionando el botón de lista de puntos en el cuadro de diálogo resolve3D . Debería aparecer un nuevo cuadro de diálogo titulado lista de puntos. Marca varios campos de visión que se usarán en el experimento encontrando campos de visión apropiados usando los controles de la etapa del microscopio y seleccionando la opción de marcar punto en el cuadro de diálogo de la lista de puntos.
   NOTA: Habrá que seleccionar un punto de reemplazo cada vez que el microscopio se reenfoque en un punto de la lista de puntos. Esto se puede hacer enfocando el microscopio en el punto adecuado de la lista y luego seleccionando el botón de reemplazar punto . Es importante no tocar el mando analógico de ajuste grueso/fino al reenfocar; Usa solo el software para ajustar el enfoque.
8. Establece los parámetros de time-lapse seleccionando primero la pestaña de diseño y luego de time-lapse en el cuadro de diálogo diseño/ejecutar experimento. Selecciona la casilla de time-lapse. Introduce los parámetros de time-lapse apropiados en términos de imágenes time-lapse/tiempo total.
9. Establecer puntos a imaginar de la lista seleccionando primero la pestaña de diseño y luego puntos en el cuadro de diálogo diseño/ejecutar experimento. Selecciona la opción de lista de puntos de visita e introduce los puntos a imaginar en el cuadro de texto separados por comas o guiones si la secuencia es completa.
10. Antes de comenzar un experimento, edita los nombres y ubicaciones de los archivos usando la pestaña de ejecutar en el cuadro de diálogo de diseño/ejecutar. La ubicación del archivo se puede cambiar seleccionando el botón de configuración , seleccionando la carpeta de datos y luego seleccionando la carpeta adecuada o creando una nueva. Cambiar los nombres de los archivos introduciendo el nuevo nombre en el cuadro de texto del nombre del archivo de imagen.
11. Comienza el experimento seleccionando el botón de reproducir en el cuadro de diálogo de inicio del experimento .
    NOTA: Para el time-lapse, comprueba continuamente el enfoque en cada campo de visión durante el experimento usando la configuración DIC (para evitar fotoblanqueo innecesario) y vuelve a enfocar y actualizar la información de la lista de puntos, ya que las celdas tienden a desenfocarse con el tiempo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarose	Biorreactivos de Fisher	BP160-100	Grado de Biología Molecular - Baja EEO
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopía
Plato de fondo de cristal	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopía
Microscopio	GE	DeltaVision Elite	Soporte personalizado para microscopio invertido Olympus IX-71; Torre de iluminación personalizada y módulo iluminador de luz transmitida. Objetivos: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski para objetivo 100X; cámara CoolSnap HQ2; Ensamblaje SSI de 7 colores; Cámara de control ambiental: opaca.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	Inhibidor de FtsZ
SoftWorx	GE		Software de imagen suministrado por el fabricante