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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
1. Inoculación de Listeria monocytogenes en ratones mediante inyección en venas caudales y evaluación de la carga bacteriana en el hígado, bazo y corazón
NOTA: Todo el trabajo con animales se realiza conforme a las directrices de Bioseguridad Nivel 2 del CDC. Normalmente, los ratones se piden con una semana de antelación y se enjaulan junto con 5 animales por jaula. Se deja que los ratones se aclimaten al nuevo entorno de laboratorio durante cuatro días antes de la inyección. Estos experimentos utilizaron ratones Swiss-Webster hembras de 6-8 semanas que fueron alojadas 5 por jaula en un entorno barrera y alimentadas con una dieta no restringida.
- Prepara una jaula de ratones a la vez quitando la tapa y los contenedores de comida/agua, y coloca la jaula bajo una lámpara de calor durante cinco minutos. Este proceso permite que las venas caudales se dilaten, facilitando la realización de inyecciones.
- Retira un animal y colócalo en un arnés (o tubo de halcón con el extremo cortado) para sujetarlo durante la inyección.
- Limpia el lugar de la inyección con una compresa de alcohol y deja que el alcohol se evapore. Esto no solo limpia el lugar, sino que también dilata aún más la vena caudal.
- Utilizando una jeringuilla de 1 ml equipada con una aguja calibre 27,5, inyecta suavemente al ratón 200 μl del cultivo deseado en la vena caudal.
- Utiliza una gasa para detener cualquier sangrado que pueda ocurrir como resultado de la inyección y coloca al animal en una jaula limpia.
- Repite este proceso para los animales y cepas restantes. Asegúrate de etiquetar cada jaula con la cepa que han recibido.
- Revisa a los animales a diario, retirando y sacrificando a cualquier animal que parezca estar enfermo. Si ningún animal presenta signos de enfermedad, permite que las infecciones continúen durante 72 horas antes de sacrificar a todos los animales.
- Para sacrificar, utiliza anestesia de CO2 de una fuente embotellada hasta que se hayan detenido todas las respiraciones, y luego usa dislocación cervical para asegurarte de que el animal está muerto.
- Tras el sacrificio, traslada a los animales a una capucha de cultivo de tejidos para su disección.
- Usando un bloque de disección, sujeta cada pata del animal con agujas de calibre grande y rocía el animal con un 70% de etanol hasta que esté saturado.
- Corta la piel del abdomen y el tórax hacia atrás usando una incisión en forma de Y que se extiende desde la abertura vaginal hasta el proceso xifoides, avanzando y luego hasta la axila de cada brazo.
- Retira la piel y retira las agujas de cada pata para mantener la disección abierta.
- Corta suavemente el peritoneo, dejando al descubierto los intestinos, el estómago, el hígado y el bazo.
- Primero cortando la vena hepática y el ligamento coronal en la parte superior del hígado, comienza a extraer el hígado. Se encuentran ligamentos adicionales que se deben extraer bajo el hígado, conectándolo con la primera sección del intestino delgado, así como con la musculatura de la espalda.
- Coloca el hígado en 5 ml de ddH20 estéril en un tubo de halcón de 50 ml.
- A continuación, retira el bazo aislándolo y cortando suavemente los vasos vasculares y los ligamentos. El bazo se extraerá más fácilmente que el hígado. Coloca el bazo en un tubo de halcón separado que contiene 5 ml de ddH20 estéril.
- Localiza el diafragma y corta suavemente a lo largo de la caja torácica para visualizar el tórax. Corta el proceso xifoides y el esternón hasta el nivel del cuello para abrir el tórax, exponiendo el corazón y los pulmones.
- Con pinzas, agarra suavemente el corazón por su vértice y levántalo de modo que la aorta y los vasos pulmonares estén en tensión. Corta estos vasos para liberar el corazón.
- Coloca el corazón en un tubo de halcón de 50 ml que contiene 5 ml de ddH20 estéril.
- Descarte el cadáver del ratón y repita este proceso para cada animal, utilizando tubos limpios de halcón que contienen 5 ml de ddH20 estériles para cada órgano extraído.
- Después de extraer todos los órganos, limpia la estación de trabajo y vuelve al banco.
- Prepara un juego de 5 tubos para limpiar y esterilizar el homogeneizador de cada conjunto de órganos de cinco ratones (es decir, un juego de 5 tubos para 5 hígados, 5 tubos para 5 bazos y 5 tubos para 5 corazones). Cuatro de cada tubo deben llenarse con 30 ml de ddH20 estéril, y uno con 30 ml de EtOH al 90%.
- Usando un TissueMaster (o homogeneizador equivalente), sumerge el homogeneizador (mientras se corre) en los tubos preparados en el paso 1.21 de la siguiente manera para limpiar la sonda:
- Tubo 1 (ddH2O) 5 seg en Tubo 2 (ddH2O) 5 seg en Tubo 3 (EtOH) 5 seg en Tubo 4 (ddH2O) 5 segundos en Tubo 5 (ddH2O)
- Homogeneiza un hígado usando el homogeneizador durante al menos 2 minutos, o hasta que no queden partes visibles del órgano. Usa pinzas para eliminar cualquier suciedad grande de la sonda.
- Repite el proceso de limpieza descrito.
- Repite el proceso de homogeneización para los otros hígados, asegurándote de lavar la sonda entre cada hígado siguiendo el proceso descrito.
- Después de que todos los hígados estén completamente homogeneizados, descarta los tubos de lavado (1-5) para el hígado.
- Repite el proceso de homogeneización/limpieza tanto para el bazo como para el corazón, asegurándote de usar un nuevo juego de tubos de lavado para cada serie de órganos. Si en algún momento los tubos de lavado se vuelven turbios, deséchalos y reemcáyelos por tubos nuevos para terminar la serie.
- Después de homogeneizar todos los órganos, haz un último ciclo de limpieza en el homogeneizador y sécalo bien para su almacenamiento.
- Colocar aproximadamente 200 μl de cada órgano en un pozo individual de una placa de 96 pozos.
- Realiza diluciones en serie en muestras de órganos diluyendo 1:10 en una serie hasta una dilución 1:10.000 (hígado y bazo) o hasta una dilución 1:1.000 (corazón).
- Placar la serie de dilución en un agaro LB precalentado. También retirar 20 ul de cada órgano sin diluir y colocar placas de agar LB separadas para enumerar la UFC de órganos poco colonizados.
- Descarta los tubos de halcón que contienen los órganos homogeneizados y envuelve las placas de 96 pozos que contienen la serie de dilución con parafilm y colócalos en una caja congeladora a -80 °C.
- Deja que las manchas se sequen. Este proceso se acelera colocando las placas en la campana y retirando las tapas.
- Después de que las manchas se hayan secado, coloca los platos en una incubadora a 37 °C durante la noche.
- Cuenta el número de colonias en cada zona a la mañana siguiente y utiliza la serie de dilución para calcular el número total de bacterias por órgano.