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Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.
1. Infección
- Obtén ratones BALB/c de ambos sexos entre las 10 y 12 semanas de edad.
NOTA: La cepa TIGR4 de Streptococcus pneumoniae serotipo 4 es un aislado clínico virulento que ha sido secuenciado. - Cultivar TIGR4 en caldo Todd-Hewitt a 37 °C con un 5% deCO2 hasta alcanzar una densidad óptica (OD)620 de 0,5 (correspondiente a 1,0 x 10 8 unidades formadorasde colonias [CFU]/ml). Pellete el cultivo neumocócico mediante centrifugación durante 10 minutos a 3.500 x g y retire el sobrenadante usando una línea de vacío. Suspender y diluir bacterias con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 1,0 x 104 UFC/ml.
- Utilizando una cámara de inducción, anestesiamos ratones con isoflurano vaporizado al 2,5% en oxígeno. Confirma el estado de anestesia pellizcando suavemente el dedo del pie con unas pinzas romas.
- Sujetando al ratón anestesiado por la nuca y erguido con una mano, inyecta a cada ratón intraperitonealmente (i.p.) 100 μl de la suspensión de S. pneumoniae usando una jeringuilla con una aguja calibre 27-30 (correspondiente a una dosis de desafío de 1,0 x 103 UFC). Vuelve a colocar al ratón en su jaula. Los ratones suelen despertar 30-40 segundos después de la inyección.
- Deja que la infección continúe durante al menos 24 (temprano) o 30 (avanzados) horas.
- Eutanasia a los ratones mediante asfixia por CO2 . Realiza una luxación cervical para asegurarte de que el ratón ha fallecido. La eutanasia se confirma aún más con la extirpación del corazón en el Paso 1.6.
- Desinfecta la cola con un hisopo de alcohol y corta una sección de 2-3 mm. Recoger 2 μl de sangre y diluir la sangre en serie 10 veces en PBS que contenga heparina sódica 1 U/ml cinco veces. Diluciones en serie de placas en una placa de agar de sangre de soja tríptica e incubarse durante la noche a 37 °C en un 5% deCO2. Al día siguiente, la extrapola de la colonia el nivel de bacteriemia.
- Inmoviliza al ratón en posición supina sobre una plataforma quirúrgica. Rocía el cofre con etanol al 70% y seca con tapetes. Con tijeras quirúrgicas y pinzas, abre la cavidad torácica, retira la caja torácica y corta el diafragma para exponer el corazón y los pulmones. Con tijeras, corta los vasos sanguíneos conectados al corazón y extice suavemente el corazón con cuidado para evitar hematomas con pinzas.
- Enjuaga el corazón con PBS y luego colócalo en casetes de recogida de muestras de tejido para obtener secciones coronales durante la sección. Para la incrustación de parafina, coloca los casetes en una solución de formalina buffeada al 10% y al día siguiente solicita la incrustación de parafina.
- Alternativamente, se puede congelar rápidamente usando un compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T.) dentro de un criomold colocado sobre hielo seco.
2. Visualización de lesiones cardíacas y neumococos dentro de las lesiones
- Corta las secciones cardíacas incrustadas con parafina de modo que las 4 cámaras del corazón sean visibles en cada sección de tejido. Corta las láminas con un grosor de 5 μm.
- Deparafinizar y teñir las láminas con hematoxilina y eosina (H&E) utilizando métodos estándar.
- Observa secciones cardíacas teñidas con H&E usando un microscopio óptico a aumentos bajos (100X, 200X) y altos (inmersión en aceite: 400X, 1.000X). Caracterizar los corazones por la presencia de microlesiones en el miocardio. Aquí, adquiere imágenes H&E usando un microscopio Zeiss Axioskop 2 equipado con un objetivo de apertura numérica Plan-NEOFLUAR de 100X 1.3.
NOTA: En las primeras fases, las lesiones cardíacas se distinguen por su diferente color y, en algunos casos, por la presencia de células inmunitarias (monocitos y granulocitos), que parecen ser monocitos. En lesiones avanzadas, especialmente las observadas a las 30 horas, no hay células inmunitarias y en su lugar se observan grandes lesiones similares a vacúolas. Es importante señalar que, aunque puede producirse un flujo de células inmunitarias durante las primeras etapas del desarrollo de la lesión cardíaca, no parece ser un requisito.