Detección por PCR de patógenos transmitidos por alimentos a partir de muestras enriquecidas de moscas

Resumen

Fuente: Pava-Ripoll, et al. Detección de patógenos bacterianos transmitidos por alimentos en moscas de la suciedad individuales. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demuestra un método basado en PCR que amplifica el ADN bacteriano objetivo de muestras de moscas enriquecidas utilizando tabletas específicas de patógenos, permitiendo la detección de fluorescencia en tiempo real y el análisis de curvas de fusión para confirmar la presencia de patógenos transmitidos por alimentos en insectos individuales.

Protocolo

1. Comprimidos listos para PCR (reacción en cadena de la polimerasa) hidratados

1. Selecciona un bloque de refrigeración PCR refrigerado (4 °C) y coloca un soporte para tubos de PCR sobre el inserto.
2. Coloca los tubos de PCR correspondientes que contienen las tabletas listas para PCR (incluidas con cada kit) para el patógeno alimentario objetivo en el portapapeles, según el archivo del rack.
3. Con la herramienta de destapado, retira cuidadosamente los condensadores de los tubos de PCR. Descarta los tapones y verifica que cada tubo contenga una pastilla.
4. Transfiere 50 μl (para Salmonella y Cronobacter) o 30 μl (para L. monocytogenes) de lisato a tubos PCR específicos. Usa condensadores ópticos nuevos y fíjalos firmemente a los tubos de PCR usando la herramienta de tapado.
   NOTA: Tras añadir el lisato a las tabletas listas para PCR, las muestras deben permanecer frías a 2 - 8 °C hasta que se carguen en el sistema de detección basado en PCR. Los tubos de PCR pueden centrifugarse a 2.500 x g durante unos segundos para asegurar que el volumen completo esté en el fondo del tubo.
5. Carga los tubos de PCR en el instrumento del sistema de ciclo/detección de PCR abriendo el cajón de instrumentos.
6. Coloca el estante de tubos de PCR en los pozos del cajón y comprueba que los tubos estén bien colocados.
7. Cierra el cajón e inicia el programa según el protocolo del fabricante.
   NOTA: El instrumento basado en PCR tiene parámetros de ciclo preestablecidos para cada patógeno transmitido por alimentos.
8. Verifica que la barra de estado del ciclo de la PCR muestre una barra azul que indica que la parte de amplificación del programa está en ejecución.
   NOTA: Para ensayos PCR estándar, el tiempo de procesamiento del programa completo (amplificación y detección) tarda aproximadamente entre 3 y 3,5 horas en completarse.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Herramienta de tapeado	DuPont	D11677028
Herramienta de desapado	DuPont	D11134095
Rack/soporte de tubos PCR	DuPont	D12701663
Pinzas de punta fina, punta recta	BioQuip	4731	Esteriliza antes de usarla. Múltiples proveedores.
Bloque de refrigeración			Múltiples proveedores.
Centrifugadora			Múltiples proveedores.