Un ensayo rápido basado en imágenes para el cribado de virulencias bacterianas inducidas por la superficie

Resumen

Fuente: Perinbam, K., y Siryaporn, A. Un ensayo rápido de virulencia bacteriana basado en imágenes usando ameba. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demuestra un método rápido basado en imágenes para evaluar la virulencia bacteriana incubando amebas con bacterias adheridas a la superficie o planctónicas, aplicando una almohadilla de agarosa de calceína-acetoximetilo (calceína-AM) y obteniendo imágenes de fluorescencia para detectar daños en las células huésped.

Protocolo

1. Microscopía - Preparación de la almohadilla de ágar

1. Prepara las almohadillas de ágar entre 30 minutos y 1 hora antes de que las amebas estén listas para mezclarse con Pseudomonas aeruginosa.
2. Microondas 50 mL de agar al 1% (p/v) en un tampón de desarrollo (DB) en un matraz de 250 mL. Mezcla cada 20 segundos hasta que desaparezcan los grumos de agar.
3. Enfría el agar fundido colocándola en un baño de agua precalentado a 55 °C durante 15 minutos.
4. Añadir 15 μL de la solución stock de calceína-AM a 15 mL del agar fundido en un tubo cónico. Mezcla invertiendo suavemente el tubo 4 o 5 veces y pasa inmediatamente al siguiente paso.
   NOTA: Realiza este paso en un tubo centrífuga de polipropileno de 15 mL. No uses un recipiente de vidrio grueso, ya que esto hará que el agar se solidifique demasiado rápido.
5. Vierte la mezcla de agar fundido sobre una placa de vidrio de 12 cm x 10 cm y deja que el agar solidifique durante 10 minutos a temperatura ambiente. Corta la almohadilla de agar solidificada en secciones más pequeñas de 1,5 cm x 1,5 cm colocando la placa de vidrio sobre una rejilla impresa y cortando a lo largo de la rejilla usando una regla metálica.
6. Mantén el gel hidratado en una caja húmeda hasta que esté listo para usar.

2. Microscopía - Preparación de la muestra de bacterias-amebas para imagen

1. Para evaluar la virulencia de células bacterianas adheridas a la superficie, añadir 10 μL de células de ameba a bacterias adheridas a la superficie.
   NOTA: Este paso describe la mezcla de amebas con bacterias.
2. Para analizar la virulencia de las células planctónicas, mezcla 10 μL de células de ameba con 10 μL de bacterias planctónicas.
   NOTA: No laves las células de ameba crecidas xénicalmente (a un OD₆₀₀ de 0,2 a 0,5) antes de mezclarlas con las bacterias. No se observará crecimiento de E. coli en el cultivo de amebas debido al uso de la solución antibiótico-antimicótica.
3. Colocar inmediatamente la almohadilla de ágar de 1,5 cm x 1,5 cm de calceín-AM del paso 1,5 sobre la mezcla bacteria-ameba en la superficie de la placa de Petri.
   NOTA: Coloca la almohadilla de agar sobre la mezcla con un movimiento rápido y suave. No bajes la almohadilla lentamente sobre la mezcla, ya que este movimiento tiende a empujar las células hacia la periferia y alejadas de la parte inferior de la almohadilla. Este paso garantizará que bacterias y amebas estén uniformemente mezcladas, inmovilizadas y que ambos tipos celulares estén confinados al mismo plano.
4. Elimina el exceso de líquido pipeteando suavemente cualquier líquido que quede alrededor de la almohadilla de ágar. Deja que la placa de Petri se seque durante 20 minutos a temperatura ambiente.
5. Cubre la placa de Petri con una tapa e incuba la mezcla inmovilizada de amebas y bacterias a temperatura ambiente durante 40 minutos adicionales. Procede al paso 3.1.
   NOTA: Es importante incubar todas las muestras durante el mismo tiempo, ya que la fluorescencia de fondo aumenta con el tiempo. Se recomienda un tiempo de incubación de 1 hora. Las incubaciones de más de 1 h son menos reproducibles, ya que las células de amebas pueden empezar a romperse.

3. Microscopía - Adquisición de imágenes

1. Fotografiar amebas usando un microscopio de fluorescencia capaz de adquirir imágenes de campo claro y fluorescente verde. Para la fluorescencia verde, se utilizan filtros de proteína de fluorescencia verde (GFP) con 474/27 nm y 525/45 nm para excitación y emisión, respectivamente. Utiliza un objetivo de 10X (apertura numérica ≥0,3) para obtener imágenes de las amebas.
   NOTA: La calcina-AM en el agar hará que las amebas moribundas fluorescan en el canal de fluorescencia verde. Por lo demás, las amebas sanas no son fluorescentes.
2. Ajusta los tiempos de adquisición para el contraste de fase, los canales GFP para limitar la fototoxicidad y optimizar el rango dinámico de las intensidades de la imagen. Si es necesario, sustituye el contraste de fase por contraste de interferencia diferencial (DIC).
   NOTA: Utiliza exposiciones de 100 a 200 ms para contraste de fase y fluorescencia GFP si es posible. Mantén la exposición y los ajustes del instrumento sin cambios durante todo el experimento. Esto es fundamental para calcular el índice de eliminación del huésped.
3. Adquiere imágenes de al menos 100 células de ameba para obtener buenas estadísticas para calcular el índice de muerte del huésped.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Bacto agar, deshidratado	BD Difco	214010
Antibiótico-Antimicoótico (100X)	Tecnologías de la vida	15240062	La cuocuota < 1 mL y se almacena a -20 °C
Éster de calceína-acetoximetilo (calceína-AM)	Tecnologías de la vida	C34852	Calceína Acetoximetil (AM)
Cloruro de calcio, anhidro	Sigma-Aldrich	C1016
D-glucosa	Fisher Chemical	D16500	Dextrosa
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D5879
Ácido fólico	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Extracto de levadura	Oxóide	LP0021
Peptone especial	Oxóide	LP0072
Hidróxido potásico	Fisher Chemical	P250
Monobásico fosfato de potasio	Sigma-Aldrich	P0662
Fosfato de sodio dibásico heptahidrato	Fisher Chemical	S373
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Detensiones
Dictyostelium discoideum	Laboratorio Siryaporn	Cepa AX318
Escherichia coli	Laboratorio Siryaporn	Deformación B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Laboratorio Siryaporn	PA14	Cepa PA14
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Laboratorio Siryaporn	AFS20.1	Cepa 20 derivada de PA14
Suministros
Filtro de 0,22 μm	Millipore	SCGPT01RE	Para la esterilización por filtro
Tubo cónico, 15 mL	Corning	352097
Botellas de almacenamiento de vidrio	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Placa de Petri, 6 cm de diámetro	Corning	351007	Placas de poliestireno de 60 x 15 mm
Placa de Petri, 10 cm de diámetro	Fisher	FB0875712	Placas de poliestireno de 100 x 15 mm
Recipientes de plástico con tapa	Ziploc	2.57E+09	Recipientes cuadrados de 3 tazas
Placas de vidrio	Bio-Rad	1653308	Para preparar almohadillas de agar. Otras placas de vidrio pueden usarse con dimensiones similares.
Palos de madera	Fisher	23-400-102
Equipamiento
Microscopio Eclipse Ti-E	Nikon	MEA53100	Montaje del microscopio
10X Plan Fluor Ph1 objetivo 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Montaje del microscopio
Fuente de excitación por fluorescencia	Lumencor	Motor ligero Sola	Montaje del microscopio
Conjunto de filtros de fluorescencia	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Montaje del microscopio
Cámara Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu	77054098	Montaje del microscopio
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software para análisis de imágenes
MATLAB	Mathworks	R2013	Software para análisis de imágenes
Incubadora de agitadores orbitales	VWR	89032-092	Para el crecimiento de bacterias a 37 °C
Agitador de plataforma	Fisher	13-687-700	Para el crecimiento de amebas a 22 °C
Espectrofotómetro	Biochrom	Ultrospec 10
Incubadora refrigerada bajo la encimera	Fisher	97990E	Para el crecimiento de amebas a 22 °C
Bany de agua isotemp	Fisher	15-462-21Q	Para medios de refrigeración a 55 °C