Evaluación de la carga bacteriana en el bazo de ratón para estudios de infección

Resumen

Fuente: Madenspacher, J. H. y Fessler, M. B. Un método no invasivo y técnicamente no intensivo para la inducción y fenotipado de neumonía bacteriana experimental en ratones. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra el proceso de cuantificar la carga bacteriana en el bazo de un ratón infectado para evaluar la gravedad de la infección. El bazo homogeneizado se diluye en serie y se coloca en placas para determinar la carga bacteriana total. Los datos resultantes proporcionan información sobre las interacciones huésped-patógeno dentro del tejido sistémico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Aspiración intratraqueal murina de Klebsiella pneumoniae en la orofaringe

1. Asegúrate de que los ratones se identifiquen de forma única por la marca de la cola, tatuaje u otro identificador aprobado.
2. Elabora un inóculo dosificador de bacterias usando una pipeta P200 antes de extraer ratones del isoflurano para agilizar el procedimiento. Para obtener mejores resultados con aspiración de i.t., utiliza un volumen de <100 μl para evitar desbordamientos. En este caso, utiliza 2000 unidades formadoras de colonias (UFC)/50 μl de K. pneumoniae.
3. Anestesiar ratones en una cámara transparente con gas isoflurano (por ejemplo, 2% de isoflurano a un caudal de 1 L/min) o según las directrices institucionales. El número de ratones que anestesian juntos depende del nivel de comodidad del experimentador, normalmente de 1 a 2 a la vez. Observa la respiración y confirma el nivel de anestesia una vez que se vean respiraciones profundas y se pueden contar entre 2 y 3 segundos entre respiraciones. NOTA: Si existe preocupación por posibles efectos de confusión de anestésicos volátiles (inhalados), la anestesia puede lograrse en su lugar con la inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina. Con el método descrito anteriormente, la anestesia profunda solo dura unos minutos. Si se induce una anestesia prolongada, se debe usar pomada ocular para evitar la desecación ocular.
4. Una vez anestesiado, colócalo en posición semi-reclinada en posición supina, suspendida por los incisivos maxilares de una goma elástica estirada entre clavijas sobre una tabla inclinada de Plexiglás (Figura 1).
5. Tira suavemente de la lengua del ratón hacia un lado con un par de pinzas romas y sin estrías y deposita la dosis en la cavidad oral con una pipeta P200. Ten mucho cuidado para evitar causar traumatismos tanto en la lengua como en la orofaringe.
6. Mientras mantienes la lengua retraída, ocluye suavemente la nariz con un dedo enguantado hasta que el ratón inhale. Sigue cubriendo la nariz hasta que el ratón haya inhalado dos o más veces y no haya líquido visible en la cavidad oral. Cubrir la nariz ayuda a asegurar que el ratón inhale las bacterias hacia los pulmones, ya que los ratones son respiradores nasales obligatorios.
7. Retira al ratón de la tabla de inoculación y vuelve a su jaula, colocándole boca arriba para evitar que la cama o los restos bloqueen las narinas mientras se recupera de la anestesia.
8. Una vez que todos los ratones hayan sido dosificados y hayan despertado de la anestesia, que los ratones de casa estén en un cubículo/habitación que contenga solo ratones que hayan sido dosificados con K. pneumoniae. Vigila a los ratones a diario, incluyendo el peso corporal, si pasan más de 48 horas después de la infección.
9. Usa macerado diario y/o calor suplementario si dejas que los ratones superen las 48 horas.

2. Determinación de la carga bacteriana en los tejidos pulmonares y periféricos

1. Antes de comenzar: prepara tubos de dilución con 900 μl de 1x suero fosfatado (PBS) para pulmón y bazo y 90 μl de 1x PBS para la sangre. Etiquetar placas para cultivar bacterias y fijarlas a temperatura ambiente; por lo tanto, una vez recogido el tejido, se minimizará el tiempo entre la homogeneización y el blindaje para el crecimiento bacteriano.
   NOTA: Debido a la deposición heterogénea de bacterias en los pulmones que puede ocurrir con aspiración, se recomienda utilizar ratones individuales para el análisis de la cellularidad total de las vías respiratorias o de la carga bacteriana total (bilateral) pulmonar.
2. Eutanasia a ratones según las directrices institucionales. Aquí, utilice una inyección letal de 150 mg/kg de pentobarbital sódico o una dosis equivalente de solución comercial para la eutanasia, seguida de una exanguinación, ya que así se evitan posibles complicaciones pulmonares asociadas a la inhalación de CO₂ y la luxación cervical.
3. Quita el bazo y colócalo en 2 ml de 1x PBS. Coloca tubos sobre hielo. Ten cuidado de limpiar los instrumentos con etanol entre cada pañuelo/ratón.
4. Homogeneiza el tejido sobre hielo, preferiblemente con homogeneizadores desechables que puedan cambiarse entre cada muestra. Las puntas desechables de homogeneización pueden ser autoclavadas para su reutilización entre experimentos.
5. Una vez que el tejido ha sido homogeneizado, realiza diluciones en serie y placa de placas. Toma muestras de un tejido o dilución dado en duplicado sobre una sola placa de agar de soja tríptico (TSA) dibujando una línea divisoria en el plástico. A continuación se muestran las sugerencias de plateado y dilución (en todos los casos, se distribuyen 10 μl de muestra sobre la placa) y se basan en una necropsia de 24 horas después de la infección. Si se analizan muestras de 48-72 horas, puede ser necesario plasmar un mayor número de diluciones debido al aumento de la carga bacteriana en momentos posteriores
   1. Para el bazo: diluir 1:10-1:100 añadiendo 100 μl de bazo homogeneizado a 900 μl de PBS estéril 1x en serie. La placa se homogenea limpiamente y ambas diluciones duplicadas.
6. Deja que las muestras se sequen brevemente.
7. Invierte las placas TSA y colócalas en una incubadora estática a 37 °C durante la noche.
8. Determina el número de bacterias colonizadoras promediando las colonias bacterianas de ambos lados de la placa y de cada dilución. Ten en cuenta las diluciones iniciales de 5 ml para el pulmón y 2 ml para el bazo para determinar las UFC totales del tejido.

Resultados

Figura 1: Junta de procedimientos para neumonía por aspiración en ratones. Los ratones de estudio se colocan con la cabeza hacia arriba y de espaldas a la tabla (es decir, semireclinados), suspendidos por los incisivos de una gom...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ATCC	43816
Becton Dickenson	211825
Preparado internamente	N/D	Agua destilada (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na₂HPO₄ (5,75 g), KH₂PO₄ (1 g)