Visualización de metabolitos de aminoácidos en tejidos intestinales de ratones infectados

Resumen

Fuente: Specker, J. T., et al. Investigación de la cooperación microbiana mediante análisis por espectrometría de masas por imagen de colonias bacterianas crecidas en agar y en tejido durante la infección. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demuestra el uso de espectrometría de masas asistida por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) para visualizar la distribución de aminoácidos en tejidos intestinales de ratones infectados con Clostridioides difficile, sola o en combinación con Enterococcus faecalis. El procedimiento implica la preparación de tejidos, la aplicación de matrices, la ionización láser y la detección de iones aminoácidos para generar imágenes espaciales de iones. Los resultados revelan cooperación microbiana, ya que E. faecalis altera el entorno intestinal liberando ornitina y agotando la arginina, aumentando así la patogénesis de C. difficile .

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Preparación y envío de tejidos cecales de ratón no infectados y de control no infectados por C. difficile
   1. Inocular a ratones machos de 4-8 semanas con C57BL/6 machos con antibióticos (0,5 mg/mL cefoperazona o 0,5 mg/mL cefoperazona + 1 mg/mL vancomicina) en agua potable ad libitum durante 5 días, seguido de un periodo de recuperación de 2 días y la posterior infección.
   2. Eutanasia a los animales por asfixia con CO₂ y recolecta inmediatamente el órgano del ceco del ratón. Inyecte en una mezcla al 20% de compuesto a temperatura óptima de corte (OCT) en agua destilada.
   3. Coloca las muestras sobre hielo seco y luego encaja y envía para su análisis; almacenar a -80 °C hasta el análisis.

 

2. Criosección de control no infectado frente a tejidos cecales de ratón infectados por C. difficile

1. Limpia todo el equipo de criosección enjuagándolo con etanol al 100% y deja que seque antes de colocar las muestras en la cámara del criostato. Prepara las láminas de microscopio recubiertas con ITO utilizando un óhmmetro para identificar el lateral de la lámina con el recubrimiento conductor. Utiliza una grabadora con punta de diamante para grabar y etiquetar el lado recubierto con ITO del portaobjetos del microscopio.
   NOTA: Se debe llevar el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, gafas de laboratorio, bata de laboratorio y fundas criostatales.
2. Realiza criosecciones en un criomicrotomo de investigación. Transfiere los tejidos de ceca del ratón incrustados en OCT de un congelador a -80 °C a la cámara de criomicrotomo (temperatura de cámara de 30 °C, temperatura de objeto de -28 °C) sobre hielo seco. Montar las muestras de tejido a comparar mediante espectrometría de masas por imagen (por ejemplo, control no infectado vs. infectado por C. difficile) en el mismo portaobjetos de microscopio para asegurar una preparación idéntica de muestras de ambos tipos de tejido y permitir comparaciones precisas de metabolitos.
3. Dentro de la cámara de criomicrotomos, monta el tejido incrustado en OCT sobre un mandril de muestra utilizando una solución adicional de OCT. Después de que la solución OCT se haya solidificado, fija el mandril a la cabeza de la muestra. Comienza la criosección en incrementos de 10-50 μm para alcanzar la profundidad/plano deseado del órgano.
4. Una vez alcanzada la sección transversal óptima del tejido, comienza a recoger secciones de 12 μm de espesor. Manipula suavemente la rodaja con pinceles de artista y colócala sobre una lámina de microscopio recubierta de teflón.
5. Enrolla el portaobjetos del microscopio recubiertos con ITO sobre la sección de tejido para recoger el tejido del portaobjetos recubierto de Teflón. Descongela la sección de tejido en la lámina del microscopio presionando la palma contra la parte trasera de la lámina recubierta con ITO. Sigue descongelando el montaje hasta que la sección de tejido pase de translúcida a opaca/mate.
6. Transfiere las láminas del microscopio montadas en tejido sobre hielo seco a una caja seca con desecante para su almacenamiento en el mismo día, o guarda a -80 °C para un almacenamiento a largo plazo.

3. Preparación de tejidos cecales de ratón no infectados frente a Tejidos cecales de ratón infectados por C. difficile para aplicación de matrices y espectrometría de masas por imagen MALDI

1. Realizar la aplicación de la matriz MALDI (temperatura de tobera de 30 °C, ocho pasadas, caudal de 0,1 mL/min, patrón CC, tiempo de secado de 0 s, 10 psi).
2. Realizar espectrometría de masas de imagen MALDI
3. Analizar las imágenes iónicas de múltiples réplicas biológicas y comparar los resultados para significar mediante comparaciones de diagramas de caja de intensidad utilizando el software estadístico SCiLS mencionado anteriormente.
   NOTA: Las pruebas estadísticas y comparaciones adecuadas dependerán de la aplicación y pueden incluir segmentación espacial, modelos de clasificación y análisis comparativos para determinar características espectrales discriminativas y correlacionadas. Los análisis comparativos pueden incluir la asignación de valores p a características significativas, la generación de análisis de componentes principales para comparaciones de tejidos y la visualización de diagramas de caja para identificar variaciones. También es útil visualizar el tejido mediante microscopía de campo claro de la sección tisular teñida mediante hematoxilina y eosina (H&E) tras espectrometría de masas por imagen. Esto permite la identificación clara de las características morfológicas en el tejido y puede analizarse en consulta con un patólogo formado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtros de jeringuilla Titan3 de 0,2 μm	Termo Científica	42225-NN
Matriz MALDI de 1,5-diaminonaftaleno	Sigma Aldrich	2243-62-1
Jeringuillas Henke Ject luer lock de 20 mL	Henke Sass Lobo	4200.000V0
Manómetro de vacío por convección serie 275i	Empresa de Kurt J. Lesker	KJL275807LL
Espectrómetro de masas 7T solariX FTICR equipado con un sistema láser Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Solución de ácido acético, adecuada para HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitrilo, adecuado para HPLC, grado gradiente, ≥99,9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Solución de hidróxido de amonio, 28% de NH3 en H2O, ≥99,99% base de metales traza	Sigma Aldrich	1336-21-6
Bolsas de biohazard autoclavables: 55 galones	Grainger	45TV10
Bolsas de transporte de muestras de riesgo biológico (8 x 8 pulgadas).	Fisher Scientific	01-800-07
Caldo de infusión cerebral	BD Biociencias	90003-040
C57BL/6 ratones machos	Laboratorios Jackson
Escáner de fotos y documentos CanoScan 9000F Mark II	Canon
Criomicrotomo de investigación CM 3050S	Leica Biosystems
Gabinete desecador	Sigma Aldrich	Z268135
Escritor de puntas de diamante, Ciencias de Microscopía Electrónica	Fisher Scientific	50-254-51
Pellets desecantes de drierita	Drierita	21005
Etanol, 200 grados	Laboratorios de Descontaminación	2701
Software flexImaging	Bruker Daltonics
Software ftmsControl	Bruker Daltonics
Trampa de vidrio para vacío	Sigma Aldrich	Z549460
Pulverizador robótico HTX M5 TM	Tecnologías HTX
Portaobjetos de microscopio recubiertos con óxido de indio estaño (ITO)	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Filtro HEPA en línea a bomba de vacío	LABCONCO	7386500
Metanol, grado HPLC	Fisher Chemical	67-56-1
Adaptador deslizante MTP II	Bruker Daltonics	235380
Compuesto a temperatura óptima de corte (OCT)	Fischer Scientific	23-730-571
Esporicidio, desinfectante y limpiador de RTU Peridox	CONTEC	CR85335
Láminas impresas de PTFE (Teflón), Electronic Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Bomba de vacío de paletas rotatorias RV8	Edwards	A65401903
Cuchillas desechables de microtomo de alto perfil Tissue-Tek Accu-Edge	Ciencias de la Microscopía Electrónica	63068-HP
Tubo de vacío transparente	Cole Palmer	EW-06414-30
Aceite de bomba de vacío Ultragrado 19	Edwards	H11025011
Transformador de tensión variable	Powerstat
Agua, adecuada para HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Matraz dewar de boca ancha	Sigma Aldrich	Z120790