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1. Evaluación del efecto de los inhibidores de pequeñas moléculas en la formación de películas y colonias de biopelículas
- Prepara una solución 2x de medio definido para inducir biofilm MSgg (glutamato-glicerol monosódico) sin cloruro de calcio ni cloruro de hierro hexahidrato. Después de la esterilización con filtro, añade el cloruro de calcio. El medio está listo para usarse directamente, o puede almacenarse a 4 °C en la oscuridad.
- Prepara la dilución 1x de MSgg el día del experimento.
- Diluir el medio 2x MSgg a 1x con agua destilada estéril (películas) o agar estéril al 3% caliente (80 °C) (biofilms) y añadir cloruro de hierro(III) hexahidrato a una concentración final de 50 μM (películas) o 250 μM (biofilmes). Añade antibióticos o inhibidores de pequeñas moléculas a la concentración deseada y mezcla bien. Por ejemplo, para obtener una concentración final de 0,5 mM de D-leucina en 30 ml para establecer películas o biopelículas, añadir 196,6 μl de una solución de D-leucina de 76,3 mM (10 mg/ml).
NOTA: La composición final de 1x MSgg se describe en la Tabla 1. En comparación con la receta original, el medio contenía 50 μg/ml de treonina, y la concentración de hierro para cultivar colonias de biofilm en medio sólido MSgg se incrementó 2,5 veces para optimizar la morfología arrugada de la colonia.
- Tras la solidificación del agar, seca las placas sólidas de MSgg en una capucha biológica durante 30-45 minutos antes de la inoculación.
- Para seleccionar inhibidores específicos que interfieran con los mecanismos de formación de la película (Figura 1), descartar que las concentraciones utilizadas afecten al crecimiento planctónico y estático.
- Determina el crecimiento planctónico (aumento de la densidad óptica a lo largo del tiempo en cultivo líquido) en una curva de crecimiento simple midiendo la densidad óptica a 600 nm cada hora hasta la fase de crecimiento estacionario.
- Para confirmar que la turbidez medida en cultivo representa el recuento de células vivas, determina el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de células en la fase de crecimiento planctónico a partir de un cultivo agitado en varios puntos temporales.
- Para evaluar el efecto de los inhibidores de pequeñas moléculas sobre el crecimiento estático de la película, se extraen células al final de una incubación de 3 días a 23 °C de un pozo de cultivo celular de 24 pozos, inoculados bajo las mismas condiciones descritas en las secciones 1.7-1.9, y se determina la UFC. Para este control, se utiliza una deformación deficiente en película que careza de operones que codifican los componentes de la matriz extracelular (es decir, B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
NOTA: Esta cepa es capaz de crecer en condiciones estáticas, pero a diferencia de un tipo salvaje que forma películas, carece de capacidad para flotar hasta la interfaz líquido-aire, donde el crecimiento favorece debido al aumento de los niveles de osígeno. Por tanto, esta cepa extracelular deficiente en matriz y película es una cepa de referencia recomendada para evaluar el crecimiento en condiciones estáticas.
NOTA: Para el ejemplo específico del aminoácido D no canónico D-leucina descrito a continuación, se descartó un efecto sobre el crecimiento planctónico y estático en concentraciones que interferían con la formación de la película. Se describen en detalle los métodos para determinar el crecimiento planctónico y estático.
- Extraer B. subtilis de un material a -80 °C (cultivo LB de 109 células/ml congelados en 20% de glicerol) para aislar colonias individuales en una placa de agar LB-1,5% con una punta estéril o un aplicador.
- Cultiva durante la noche a 30 °C.
- PASO CRÍTICO: Para una inhibición robusta de la película por aminoácidos D no canónicos como la D-leucina, cultiva una sola colonia extraída de la placa de agar LB-1,5% en 3 ml de caldo LB a 37 °C durante 4 horas en una incubadora agitada (velocidad de agitación 200 rpm). Sustituye el caldo LB por un medio MSgg inductor de biofilm antes de la inoculación centrifugando 1,5 ml de cultivo inicial durante 4 minutos a 6.000 x g, retirando cuidadosamente el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en 1,5 ml de medio MSgg. El resto de la cultura puede ser descartado. Importante: Para garantizar la robustez del sistema, la densidad óptica a 600 nm (OD600) del cultivo de arranque lavado debe estar entre 0,6 y 1.
- Durante el crecimiento del cultivo iniciador, preparar una placa multidish de cultivo celular de 12 pozos que contenga 3 ml de medio MSgg sin o con un rango de concentración del inhibidor de moléculas pequeñas (por ejemplo, 0,3, 0,5, 1 mM de D-leucina). Para descartar efectos de borde, distribuye la ubicación de las diferentes concentraciones a lo largo de la placa multiplaca. Alternativamente, utiliza placas multidish de cultivo celular de 24 pozos que contienen 1,5 ml de medio MSgg.
- Inocula los pozos de la placa multidish de cultivo celular de 12 pozos con 3 μl del cultivo inicial lavado (dilución 1:1.000).
NOTA: Se puede usar una relación de dilución menor, es decir, 1:500. Esto disminuye el tiempo de desarrollo de las películas. - Cultiva las películas a 23 °C en condiciones estáticas durante tres días. No mueva las películas durante este tiempo, ya que puede afectar a la morfología superficial final de la película.
- Toma fotos con prismáticos y exposiciones homogéneas de rayos. Alternativamente, haz una foto de las películas con una cámara de alta resolución. Para evitar artefactos causados por ángulos de luz y sombras inconsistentes, toma fotos cenitales con la cámara fija en un trípode y utiliza una fuente de luz suave y grande a 45° desde ambos lados.
NOTA: Un método alternativo para estudiar la multicellularidad de B. subtilis es el ensayo de colonia de biopelículas en medio sólido que induce biofilm MSgg. Al igual que las películas, este ensayo permite el estudio de procesos espaciotemporales. Una vez determinado el rango activo de los inhibidores de moléculas pequeñas, se puede estudiar su efecto en la formación de colonias de biofilmes. - Para cultivar colonias de biofilm, se pone simétricamente 1,5 μl del precultivo sin lavar (Paso 1.7) sobre la placa de agar MSgg seca al 1,5% con la ayuda de una plantilla — 4 gotas por placa de Petri de 8,5 cm de diámetro. Deja que las gotas se absorban en la placa antes de moverlas.
NOTA: La plantilla ayuda a obtener una distribución equitativa de las colonias de biofilm dentro del área donde crecen las células. Para preparar la plantilla, dibuja el área total de crecimiento a escala original, divídela en sectores iguales y marca el centro. Para una placa de Petri redonda de 8,5 cm de diámetro, esto asigna 14cm 2 a una colonia de biofilm. - Incuba las placas a 30 °C durante tres días. Durante este tiempo, las colonias de biofilm se desarrollan y forman una estructura tridimensional y arrugada.
- Haz fotos como en el paso 1.11.
Tabla 1. Composición final de 1x MSgg utilizada en este estudio.
| 1,925 mM | Monobásico fosfato de potasio |
| 3,075 mM | Dibásico fosfato de potasio |
| 100 mM | ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico, pH 7,1 |
| 2 mM | Cloruro de magnesio hexahidrato |
| 700 μM | Cloruro de calcio anhidro |
| 50 μMa | Cloruro de hierro(III) hexahidrato |
| 125μM b |
| 1 μM | Cloruro de zinc anhidro |
| 2 μM | Clorhidrato de tiamina |
| 50 μg/ml | Triptófano |
| 50 μg/ml | Fenilalanina |
| 50 μg/ml | Treonina |
| 0,5% (v/v) | Glicerol anhidro |
| 0,5% (c/v) | Ácido L-glutámico sal monosódica hidratar |
| apara el ensayo de película; bpara ensayo de biofilm |
