Ensayo de resistencia al etanol para evaluar la integridad de la matriz de biofilm

Resumen

Fuente: Bucher, T., et al. Metodologías para el estudio de biopelículas de B. subtilis como modelo para caracterizar inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demuestra cómo la integridad de la matriz de biofilm influye en la resistencia bacteriana al etanol comparando unidades formadoras de colonias en biopelículas no tratadas y con inhibidores alterados. La reducción de las UFC en muestras tratadas con inhibidores demuestra que la matriz extracelular es esencial para proteger las células embebidas en biofilm frente al estrés antimicrobiano.

Protocolo

1. Ensayo de resistencia al etanol

1. Cultiva biofilms y, tras 68 horas de crecimiento a 30 °C, corta las colonias de biofilm en dos partes iguales con la ayuda de una cuchilla y la plantilla.
2. Levanta cuidadosamente cada mitad de la colonia de biofilm de la placa de agar con una pequeña espátula y muévela a un tubo microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 μl de suero salino tamponado con fosfato (PBS). Si es necesario, raspa las celdas restantes de la placa y transfierelas también al tubo de la microcentrífuga.
   NOTA: La segunda mitad de la colonia de biofilm se trata de forma diferencial, dependiendo de si es el control o para probar la resistencia a agentes esterilizantes.
3. Para el control, incubar la segunda mitad de la colonia de biofilm en 500 μl PBS. Para evaluar la resistencia a los agentes esterilizantes, transfiere la segunda mitad de la colonia de biofilm a 500 μl de etanol al 50% (v/v).
   NOTA: Se pueden utilizar agentes esterilizantes alternativos como el hipoclorito de sodio. Para todos los agentes esterilizantes utilizados, determina la concentración activa y el tiempo de incubación en un experimento preliminar.
4. Incuba las colonias de biofilm durante 10 minutos en la mesa a temperatura ambiente.
5. Centrifuga las colonias de biofilm durante 5 minutos a 18.000 x g y retira cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta. Añade 300 μl de PBS.
6. Sonica las células suavemente (amplitud 10%, pulso 5 segundos) con la micropunta de un sonicador.
   NOTA: La energía de sonicación debe ser suficiente para separar los agregados de biofilm. Sin embargo, una sonicación demasiado fuerte puede lisar las células. Confirma de antemano mediante microscopía óptica que la energía de sonicación utilizada no lisa las células y que todos los agregados están disueltos.
7. Añade 700 μl de PBS a un volumen final de 1 ml. Realizar una dilución en serie (hasta ^10-7) en PBS y esparcir 100 μl de 3 diluciones sobre una placa de agar LB-1,5% usando perlas de vidrio estériles.
   NOTA: Las diluciones óptimas a placar deben determinarse en un experimento preliminar, ya que esto depende de la cantidad de células en la colonia de biofilm de interés y de la tasa de supervivencia de las células en respuesta al agente esterilizante.
8. Incubar las placas durante la noche a 30 °C, contar la UFC y determinar la UFC/ml. A partir de la UFC/ml final de cada una de las medias colonias de biofilm, calcular el porcentaje de supervivientes.
   NOTA: Cuando se realice y analice según lo descrito, las dos mitades de la colonia de biofilm de control y la mitad no tratada frente a la tratada con etanol de la colonia de biofilm no tratada deberían mostrar diferencias inferiores al 10% en el recuento celular viable, verificando la simetría o la resistencia de la colonia, respectivamente. Alternativamente, los resultados pueden representarse en el total de la UFC. El recuento celular de la colonia de biofilm control y no tratada debe mantenerse en el mismo orden de magnitud. En cambio, se espera que el recuento celular de la mitad de una colonia de biofilm tratado con etanol de moléculas pequeñas disminuya en un mínimo de dos órdenes de magnitud para justificar una mayor sensibilidad al agente esterilizante.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Monobásico fosfato de potasio	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Dibásico fosfato de potasio	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
Ácido 3-(N-morfolino)propanesulfónico	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Cloruro de magnesio hexahidrato	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
Cloruro de calcio anhidro	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
Manganeso(II) cloruro tetrahidrato	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
Cloruro de hierro(III) hexahidrato	Sigma, 270,30 g/mes)	F2877-500G
Cloruro de zinc anhidro	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Clorhidrato de tiamina	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-triptófano	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenilalanina	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonina	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Glicerol anhidro	Bio-Lab Itd	712022300
Las sales monosódicas del ácido L-glutámico hidratan	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-leucina	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Etanol anhidro	Gadot	830000054
Cuchilla de afeitar	Eddison	NA
Papeles de filtro de celulosa circulares	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldehído	EMS (Ciencia de Microscopía Electrónica), 25% en agua	16220
Paraformaldehído	EMS, 16% en agua	15710
Cacodiato sódico	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Cloruro de calcio 2-hidrato	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifugadora	Centrífuga de mesa Eppendorf 5424	NA
Sonificador digital, Modelo 250, usado con Double Step Microtip	Branson	NA
Incubadora 30 °C	Carpeta	NA
Incubadora 23 °C	Carpeta	NA
Sistema de filtro, 500 ml, poliestireno	Cornig Incorporated	NA
Agitador rotatorio - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA