Preparación de colonias de biofilm bacteriano para análisis morfológicos

Resumen

Fuente: Bucher, T., et al., Metodologías para estudiar biopelículas de B. subtilis como modelo para caracterizar inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp.(2016)

Este vídeo demuestra la preparación de colonias bacterianas maduras de biofilm para imágenes de alta resolución. Cubre los pasos de fijación, deshidratación, montaje y recubrimiento metálico para preservar y visualizar la morfología de la biopelícula.

Protocolo

Preparación de muestras de colonias de biofilm para microscopía electrónica de barrido

1. Cultiva colonias de biofilm bacteriano.
2. Preparar un lote fresco de glutaraldehído al 2% (v/v), solución de paraformaldehído al 3% (v/v) en 100 mM de cacodilato de sodio, 5 mM de tampón de cloruro de calcio, pH 7,3. Prepara 5 ml de fijador para cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro.
   PRECAUCIÓN: El glutaraldehído y el paraformaldehído son peligrosos. Manipula con equipo de seguridad dentro de una campana química. Desecha las soluciones y los materiales contaminados en los residuos peligrosos.
3. Añade cuidadosamente el fijador a las colonias de biofilm, sin dispensarlo directamente sobre las biopelículas.
   NOTA: Debido al carácter hidrofóbico de la colonia de biofilm, las colonias se desprenden lentamente del agar y comienzan a flotar.
4. Sella cuidadosamente las placas con una tira de Parafilm. Incuba en un agitador rotatorio durante 2 horas a temperatura ambiente y luego transfiere las placas a 4 °C durante la noche.
5. Al día siguiente, retira cuidadosamente el líquido con una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío.
6. Añade cuidadosamente 10 ml de cacodinato sódico, 5 mM de buffer de cloruro de calcio para lavar el biofilm y incubar durante 5 minutos. Retira suavemente el líquido con la pipeta de vidrio Pasteur de la esquina de la placa para evitar dañar el biofilm, y añade una solución limpia limpia pipeteando suavemente. Repite este paso una vez.
7. Para la deshidratación de las colonias de biofilm, proceda con los siguientes pasos: 2x 5 min en_{ddH 2}O; 2x 20 min en 30% etanol; 2x 20 min en 50% etanol; 2x 20 min en 70% etanol; 2x 20 min en etanol al 96%; 2 x 30 min en etanol 100%.
   1. Añade 15 ml de líquido para cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro en cada paso y retira el líquido cuidadosamente después de cada incubación.
8. Utiliza uno de dos métodos diferentes para secar las muestras del etanol.
   1. Para secado al aire a partir de etanol:
      1. Corta un papel filtro de celulosa (diámetro de 9 cm) en cuartos. Sumergir brevemente una cuarta parte en etanol 100% y luego transferir cuidadosamente una colonia de biofilm flotante sobre ella. Pon el papel filtro húmedo en una placa de Petri forrada con papel filtro. Cubre la placa de Petri y deja que las colonias de biofilm se sequen durante la noche en una capucha química.
9. Recubre un muñón de microscopía electrónica con cinta de carbón. Con la ayuda de pinzas, transfiere cuidadosamente las colonias de biofilm al muñón. Conecta cada colonia al muñón añadiendo un puente fino de cinta de carbón, que es crucial para la eliminación de carga bajo el haz de electrones. En esta etapa, maneja las colonias de biofilm con cuidado, ya que son muy frágiles. Guarda las muestras en un desecador durante al menos 24 horas o hasta el examen.
10. El día del examen, con el microscopio electrónico de barrido (SEM), se recubren las colonias de biofilm durante 2 minutos en un ángulo de 60° en un recubrimiento de sputter de oro-paladio. Repite este paso dos veces y rota las muestras 120° entre ellas. Al final, aplica una capa de pulverización a las muestras durante 3 minutos desde arriba. La capa fina de 20 nm de oro-paladio mejora la conductividad y aumenta el contraste de la muestra para la obtención de imágenes en microscopía electrónica de barrido.
11. Guarda las muestras en un desecador para evitar la rehidratación hasta la obtención de imágenes con un microscopio electrónico de barrido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glicerol anhidro	Bio-Lab Itd	712022300
Etanol anhidro	Gadot	830000054
Cuchilla de afeitar	Eddison	NA
Papeles de filtro de celulosa circulares	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldehído	EMS (Ciencia de Microscopía Electrónica), 25% en agua	16220
Paraformaldehído	EMS, 16% en agua	15710
Cacodiato sódico	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Cloruro de calcio 2-hidrato	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Montaje de aluminio de corte	EMS, cabeza ranurada	75230
Cinta adhesiva de carbono	EMS	77825-12
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Incubadora 30 °C	Carpeta	NA
Incubadora 23 °C	Carpeta	NA
Agitador rotatorio - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
Microscopio Electrónico de Barrido Ambiental	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA