Un método de coverglass con cámara para la formación in vitro de biofilm bacteriano

Resumen

Fuente: Beaudoin, T., et al. Visualización de los efectos del esputo en el desarrollo de biofilm utilizando un modelo de coverglass con cámara. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra el uso de un tapa con cámara para estudiar el efecto de los factores del esputo derivados de pacientes con fibrosis quística en el desarrollo de biofilm bacteriano.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recogida de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Método de Coverglass con cámara para la formación de biopelículas
   1. Cultiva el aislado bacteriano de interés durante la noche en el medio deseado a 37 °C con agitación (200 rpm).
      NOTA: Se utilizaron varias bacterias diferentes, incluyendo los aislados clínicos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, complejo Burkholderia cepacia y Achromobacter xylosoxidans. La elección del medio depende de cepas y condiciones de interés, sin embargo, (caldo Luria) medios LB pueden usarse para experimentos iniciales.
   2. Desde el cultivo nocturno, colocar 40 μl de cultivo en 4 ml de medio fresco y cultivar durante 3-4 horas a 37 °C con agitación (200 RPM) para obtener un cultivo con una densidad óptica de 600 nm (OD600) de aproximadamente 0,5-0,6.
   3. Diluir el cultivo del paso 1.2 a 1/5 en el medio deseado con filtrado de esputo al 10% o sin filtrado de esputo (como control). Se pueden analizar otras concentraciones de filtrado de esputo (es decir, 50% o 100%).
   4. Utiliza 200 μl de dilución para sembrar pozos de cámaras de portaportas.
   5. Deja que las bacterias se adhieran durante 4 horas a 37 °C sin temblar.
   6. Después de 4 horas, retira el sustrato y lava suavemente el biofilm con 1x fresco. Sustituye por medios frescos de 200 μl.
      NOTA: Para estudiar los efectos del esputo sobre la biopelícula, el medio fresco debe contener sobrenadante de esputo.
   7. Deja que los biofilms crezcan durante el tiempo deseado a 37 °C sin agitar, cambiando el medio cada 12 horas, sin lavar hasta el momento de la microscopía.
      NOTA: Para estudiar el efecto de los supernadantes del esputo sobre la susceptibilidad a biofilms, se añaden antibióticos al medio tras 24 horas de crecimiento de biofilm y se mantienen en el medio hasta la tinción e imagen de los biofilms.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lab-Tek II Vidrio cubierto con cámara, borosilicato #1.5, 8 pozos	Thermo Sicher Scientific	155409
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Medios estándar para crecimiento nocturno/crecimiento de biofilm