Imagen confocal de biofilmes bacterianos inducidos por filtrados de esputo en pacientes con fibrosis quística

Resumen

Fuente: Beaudoin, T., et al. Visualización de los efectos del esputo en el desarrollo de biofilm utilizando un modelo de coverglass con cámara. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra un método in vitro para evaluar cómo la fibrosis quística derivada del paciente influye en la formación de biofilm bacteriano. Utilizando portaobjetos de cámara, tinción fluorescente y microscopía confocal, revela un mayor grosor, arquitectura alterada y una mayor biomasa viable en biofilms cultivados con esputo, destacando el papel de los componentes del hospedador en la configuración del desarrollo de biofilmes.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recogida de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

Biofilms de tinción y microscopía confocal

1. Siguiendo el tiempo de crecimiento deseado (24-48 horas es lo mejor), retira el medio de los pozos de la cámara y lava suavemente cada cámara dos veces con 300 μl de PBS estéril.
2. Prepara la mezcla de tinción para biofilm mezclando 1 μl de cada tinte (proporcionado en el kit de viabilidad) para cada ml de solución necesario. Haz tinte en agua o solución de medio.

NOTA: El fabricante recomienda el agua.

3. Añade 200 μl de mezcla de tintes a cada pozo de coverglass con cámara y incuba a temperatura ambiente, en la oscuridad durante 45 minutos.
4. Retira la mezcla de manchas de las cámaras y lava cada pozo con 300 μl de PBS estéril. Quita PBS y reemplázalo por agua dulce o medio.
5. Proceder con la visualización de biofilms mediante microscopía confocal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lab-Tek II Vidrio cubierto con cámara, borosilicato #1.5, 8 pozos	Thermo Sicher Scientific	155409
Kit de Viabilidad de Biofilm Vivo/Muerto de Filmtracer	Thermo Fisher Scientific	L10316
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Medios estándar para el crecimiento nocturno de gowth/biofilm
Solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco A)	Oxóide	BR0014G	Lavado de cámaras de biofilm tras la retirada del medio
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss