Modelado de la infección intestinal en larvas de pez cebra utilizando bacterias transmitidas por alimentos

Resumen

Fuente: Flores, E., et al. Utilizando el protozoo Paramecium caudatum como vehículo para infecciones alimentarias en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demuestra el método para establecer un modelo de infección intestinal bacteriana transmitida por alimentos en larvas de pez cebra, alimentándolas con paramecia infectada con E. coli fluorescente.

Protocolo

1. Infección alimentaria del pez cebra
   1. Incuba bacterias con Paramecia.
      1. Prepara un cocultivo de Paramecium caudatum y Escherichia coli MG1655 la noche anterior a la infección. Combinar 8 mL de medios E3, 1 mL de un cultivo continuo de paramecia y 1 mL de un cultivo de E. coli MG1655 (OD₆₀₀ = 1,0) resuspendidos en 1x E3 en matrazas de cultivo de tejido T25. Incuba los frascos a temperatura ambiente (RT) durante la noche. Para cada condición de tratamiento, prepara dos frascos de paramecia.
      2. Inocular el medio bacteriano (LB (Caldo de Lisogenia): 1 g/L de triptona, 0,5 g/L de extracto de levadura, 1 g/L de NaCl) con la cepa infecciosa de bacterias seleccionando una colonia bacteriana individual de una placa mediante un lazo de inoculación estéril. Incubar el cultivo líquido a 37 °C y dejar agitar a 110 rotaciones por minuto (rpm) durante la noche.
         NOTA: Se debe llevar equipo de protección individual (bata de laboratorio y guantes), y se deben emplear instalaciones de nivel 2 de bioseguridad al manipular agentes infecciosos.
      3. Al día siguiente, mide el OD₆₀₀ de la cultura nocturna. Calcular el volumen de cultivo necesario para lograr un OD600 de 1 cuando se resuspende en 11 mL de medio.
      4. Cosechar el volumen de bacterias mediante centrifugación a 6.000 x g durante 5 minutos, un volumen por cada matraz de paramecia. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet bacteriano en 1 mL de medio E3.
      5. Opcionalmente, pre-teñe las bacterias con un tinte fluorescente.
         1. Añade 1 μL de tinción bacteriana FM 4-64FX (solución de 5 mg/mL). Cubre el tubo con papel de aluminio para protegerlo del fotoblanqueamiento e incuba girando de extremo a extremo a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos.
         2. Elimina el exceso de tinte lavando con 1x E3: Bacterias en pellet mediante centrifugación a 6.000 x g durante 1,5 min, luego vuelve a suspender el pellet en 1 mL de medio E3. Repite el paso de lavado dos veces.
         3. Cosechar bacterias teñidas mediante ctrifugación a 6.000 x g durante 5 minutos. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet bacteriano en 1 mL de medio E3.
      6. Añade 1 mL de la suspensión bacteriana a cada uno de los dos frascos de paramecia fresca. Incubar en tiempo de descanso durante 2 horas.
         NOTA: Si trabajas con bacterias teñidas, incuba en la oscuridad en RT durante 2 horas
2. Co-cultivo de bacterias de lavado/paramecia
   1. Combina el contenido de ambos frascos de co-cultivo de paramecia/bacterias en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar muestras a 300 x g a 15 °C durante 10 minutos. Asegúrate de que la centrífuga esté preenfriada antes de este paso.
   2. Retira aproximadamente 10 mL del sobrenadante E3 usando una pipeta serológica y añade aproximadamente 10 mL de 1x E3 nuevo al tubo cónico.
      NOTA: Durante todos los pasos de lavado, es esencial ser muy rápido al retirar el sobrenadante, ya que la paramecia comenzará a nadar fuera del pellet. Centrifuga y retira el sobrenadante de un tubo a la vez para asegurar un manejo lo suficientemente rápido en este paso y evitar la pérdida de paramecia en el sobrenadante.
   3. Centrifuga muestras mediante centrifugación a 300 x g a 15 °C durante 5 minutos. Retira aproximadamente 10 mL del sobrenadante E3 usando una pipeta serológica y añade aproximadamente 10 mL de E3 1x fresco al tubo cónico. Repite este paso dos veces.
   4. Centrifugar muestras a 300 x g a 15 °C durante 5 minutos. Retira aproximadamente 10 mL del sobrenadante E3, teniendo cuidado de no alterar el pellet.
   5. Resuspender el pellet en los 10 mL restantes de medio E3 y transferir 500 μL de la suspensión a un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Aplica en pellet los 500 μL de paramecia centrifugando a 300 x g durante 5 minutos para contar el número de paramecia.
   6. Retirar 400 μL del sobrenadante E3 de la muestra de 500 μL. Añadir 20 μL de solución de formaldehído al 36,5% a los 100 μL restantes de paramecia y volver a suspender suavemente, incubando durante 5 minutos a 22 °C.
      NOTA: Este paso elimina la paramecia para permitir el contar.
   7. Mide el volumen total real usando la pipeta y graba. Diluye la suspensión de paramecia 1:1 v/v con solución de azul de tripán al 0,4%.
   8. Utiliza un contador celular o un hemocitómetro para contar el número de paramecia muerto/mL.
      NOTA: Debido al paso previo de fijación, la mayoría de las paramecias estarán muertas en este punto, pero este número refleja el número de paramecias vivas para el experimento de coincubación. Los autores no han encontrado muertes significativas por paramecia debidas a la coincubación bacteriana, por lo que esto puede descartarse como factor aquí.
3. Larvas de Paramecia y pez cebra co-incubadas
   1. Calcula la concentración de paramecia en el tubo cónico de 50 mL
   2. Calcular el volumen de paramecia lavado necesario para una concentración de 2 x 10⁵ paramecia/mL en un volumen final de 3 mL de E3.
      NOTA: La concentración de paramecia puede ajustarse en función de la dosis bacteriana deseada, que está sujeta a optimización.
   3. Anestesiar pez cebra añadiendo tricaína en 100 mM de Tris pH 8,0 a una concentración final de 100 mg/L. Transfiere 10 pez cebra a cada pozo de una placa de 6 pozos en un volumen total de 3 mL de E3 fresco que contenga la concentración adecuada de paramecia. Asegúrate de que las larvas se transfieran en la menor cantidad de líquido para que se recuperen bien de la anestesia en el receptor.
   4. Incubar a 30 °C durante 2 horas en una incubadora diurna bajo condiciones de luz diurna, para asegurar condiciones óptimas de iluminación para la captura.
   5. Lava el pez cebra al menos 5 veces transfiriendo el pez a un pozo nuevo que contenga 3 mL de E3 fresco con 100 mg/L de tricaína cada vez.
      NOTA: No intentes omitir la tricaína durante el paso de lavado. Transferir larvas móviles sin anestesia aumenta el riesgo de daño y malestar para el animal.
   6. Opcionalmente, prepara pez cebra para la imagen incrustando pez cebra en 3 mL de agarosa baja en fusión al 1% en una placa de pared negra de 6 pozos: la agarosa de baja fusión se prepara en 1xE3 y se calienta en un microondas. Una vez fundida, añade tricaína a una concentración final de 160 mg/mL. Coloca los peces bajo un estereomicroscopio, usando una punta de carga de gel clipdada, asegurándote de que la cabeza esté a la izquierda y la cola a la derecha (Figura 1). Espera 5 minutos a que la agarosa se asiente y luego superpone al pez incrustado con 1x E3 que contenga 160 mg/mL de tricaína para la imagen.

Resultados

Figura 1: Colonización de pez cebra con bacterias. Los peces cebra a 5 dpf quedaron sin infectar (A) o colonizados con mCherry que expresa (B) E. coli o (C) Salmonella enterica <...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Paramecium caudatum, vivo	Carolina	131554	No, no almacenar cultivos por debajo de la temperatura ambiente
Solución azul de tripán al 0,4%	Sigma	T8154-20ML	líquido, filtrado por estéril, adecuado para el cultivo celular; Preparado en 0,81% de cloruro de sodio y 0,06% de fosfato de potasio, dibásico
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	276855-100ML	Guarda en un armario de seguridad para disolventes
Escherichia coli, MG1655	ATCC	700926 ATCC	puede ser reemplazada por cualquier otra cepa de E. coli no patógena
Tinte FM 4-64FX	Thermo Fisher	F34653	Aliquot y tienda congelada
Formaldehído	Sigma	F8775-4X25ML
Caldo LB	Sigma	L3397-1KG
Tabletas de solución salina tamponadas con fosfato	Thermo Fisher	18912014
Tetraciclina	Sigma	87128-25G	tóxico, irritante
Tricaína (Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Solución azul de tripán, 0,4%	Sigma	93595-50ML
Agarosa UltraPure de Bajo Punto de Fusión	Thermo Fisher	16520050
Hemocitómetro o contador celular	Cualquiera
Estereomicroscopio	Cualquiera
Centrífuga de mesa
Microondas
Rueda rotadora
Incubadora de agitación calefactada
Instalaciones acuáticas
Acuarios de cría