Revelado de un biofilm bacteriano monocapa utilizando un reactor electroquímico

Resumen

Fuente: Tokunou, Y. et al., Detección electroquímica del efecto isótopico cinético del deuterio en el transporte extracelular de electrones en Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demuestra el montaje y funcionamiento de un modelo de reactor electroquímico diseñado para simular la formación de biopelículas en superficies de electrodos. La estimulación electroquímica controlada promueve la adhesión microbiana, lo que conduce al desarrollo gradual de una biopelícula bacteriana monocapa.

Protocolo

1. Construcción de un reactor electroquímico de tres electrodos (Figura 1)
   1. Coloca un sustrato de óxido dopado con indio y estaño (ITO) como electrodo de trabajo en la parte inferior del reactor.
   2. Posteriormente, inserta un cilindro de vidrio (diámetro de 2 cm) y una cubierta de politetrafluoroetileno (PTFE). Luego se inserta cloruro de plata/plata (Ag/AgCl) (cloruro de potasio, saturado en KCl) y un hilo de platino en el reactor como electrodos de referencia y de contrapeso, respectivamente.
      NOTA: Para evitar fugas de aire y solución, inserta una lámina de goma butílica entre cada componente.
   3. Añadir 4,0 mL de medio definido (DM) suplementado con 10 mM de lactato y 0,5 g/L de extracto de levadura en el reactor electroquímico.
   4. Tras confirmar que no hay fugas en el reactor electroquímico, introduce el gas nitrógeno en el reactor electroquímico durante 20 minutos para mantener condiciones anaeróbias dentro del reactor electroquímico.
      NOTA: Para evitar la contaminación con otros microbios, el gas debe filtrarse antes de fluir hacia el reactor electroquímico.
   5. Conectar el reactor electroquímico a un potenciostat y aplicar +0,4 V (frente al electrodo de hidrógeno estándar, SHE) al electrodo ITO, manteniendo la temperatura del reactor electroquímico en 30 °C mediante un sistema externo de circulación de agua.
      NOTA: Para evitar el efecto de un campo eléctrico externo, el reactor electroquímico debe colocarse en una jaula de Faraday.
2. Cultivo electroquímico de células MR-1 de S. oneidensis (Figura 1 y Figura 2)
   1. Ajustar la densidad celular de la suspensión obtenida en el paso 1.1 a una densidad óptica de 1,43 a 600 nm (DI₆₀₀) con DM suplementada con 10 mM de lactato y 0,5 g/L de extracto de levadura.
      NOTA: Para obtener el OD₆₀₀ correcto, aplica la suspensión de celda de OD₆₀₀ ≤ 0,8 a un espectrómetro UV-vis antes de ajustar el OD₆₀₀ a 1,43.
   2. Añadir 0,3 mL de la suspensión de la celda al reactor electroquímico a través del puerto de inyección usando una jeringuilla: el diámetro_{exterior 600} en el reactor cambia a 0,1.
      NOTA: La adición de una suspensión de celdas de 0,3 mL con OD₆₀₀ = 1,43 en un reactor electroquímico que contiene un medio de 4,0 mL da lugar a 4,3 mL de solución con un OD₆₀₀ = 0,1. Al utilizar otros reactores con volúmenes diferentes, se requiere el cálculo de la densidad de la celda.
   3. Continúa la aplicación potencial a +0,4 V (frente a SHE) al electrodo ITO durante 25 horas.
      NOTA: Para la formación de una biopelícula monocapa en un electrodo ITO, asegúrese de que la corriente producida muestre una desviación inferior al 50% respecto a la Figura 2.

Resultados

Figura 1: Reactor electroquímico utilizado en este estudio. Fotografía de la celda electroquímica antes de la construcción (a) y después de la construcción (b). (c) Ilustración esquemática del reactor electroquímico tras 25 horas de inoculación electroq...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cilindro de cristal	N/A	N/A	Fabricado a medida, utilizado como reactor electroquímico
Cubierta y base de PTFE	N/A	N/A	Hecho a medida, utilizado como cubierta y base del reactor electroquímico
Goma butilo	N/A	N/A	Hechos a medida, insertados entre cada componente del reactor electroquímico
Septa	GL Ciencia	3007-16101	Utilizado como puerto de inyección de reactores electroquímicos
Electrodo de óxido dopado con indio con estaño (ITO)	GEOMATEC	Nº 0001	Usado como electrodo de trabajo, 5Ω/sq
Electrodo saturado en KCl en Ag/AgCl	HOKUTO DENKO	HX-R5	Usado como electrodo de referencia, Φ0,30mm
Alambre de platino	La Cooperación Nilaco	PT-351325	Utilizado como electrodo de contrapeso
Luria-Bertani (LB) Caldo, molinero	Becton, Dichkinson y Compañía	244620	Medio para el precultivo de S. oneidensis MR-1
Bacto agar	Becton, Dichkinson y Compañía	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	Usado para medio definido (DM)
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	Usado para DM
NH₄Cl	Wako	011-03015	Usado para DM
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	Usado para DM
NaCl	Wako	191-01665	Usado para DM
Ácido etanosulfónico 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilo] (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Usado para DM
Solución de lactato de sodio	Wako	195-02305
Extracto de levadura bacto	Becton, Dichkinson y Compañía	212750
Óxido de deuterio (D, 99,9%)	Cambridge Isótopos Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Aditivo para experimentos de efecto isótopico cinético
Incubadora	TOKIO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Utilizado para el precultivo
Shaker	TAITEC	NR-3	Utilizado para el precultivo
Máquina de autoclave	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Utilizado para la esterilización del reactor electroquímico y del medio
Banca limpia	SANYO	MCV-91BNF	Se utiliza para evitar la contaminación del reactor electroquímico y del medio con otros microbios
Separador de centrifugadora	Eppendorf	5430R	Se requiere una velocidad de rotación de hasta 6000×g
Generador de gas nitrógeno	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	También se puede usar un cilindro de gas nitrógeno en lugar del generador de gas
Espectrómetro UV-vis	SHIMADZU	UV-1800	Utilizado para optimizar la densidad celular
Potenciostat	BioLogic	VMP3	Utilizado para formación de biofilm y experimentos de efecto isótopo cinético
Circulador de agua termal	COMO UNO	TR-1A	Utilizado para el mantenimiento de la temperatura de reactores electroquímicos
Jaula de Faraday	HOKUTO DENKO	HS-201S	Utilizado para experimentos electroquímicos