Visualización del estrés oxidativo inducido por patógenos en C. elegans usando SKN-1 etiquetado con GFP

Resumen

Fuente: Naji, A., et al. Estudio del estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demuestra el uso de SKN-1 marcado con proteína fluorescente verde en C. elegans para monitorizar el estrés oxidativo siguiendo la fluorescencia verde. Los gusanos expuestos a S. gordonii muestran una fuerte fluorescencia nuclear, lo que confirma el estrés inducido por patógenos, mientras que los alimentados con E. coli muestran fluorescencia verde difusa en el citoplasma, lo que indica una activación mínima de SKN-1.

Protocolo

1. Observación de la localización de SKN-1 en respuesta a la infección por Streptococcus gordonii

1. Añadir ~100 larvas L4 a cada extracto de levadura Todd–Hewitt (THY) sembrado con Streptococcus y a cada medio de crecimiento nematodoico (NGM) en placa de agar sembrada con Escherichia coli (E. coli). Usa tres placas por cepa de bacterias. Incuba las placas durante 2 a 3 horas a 25 °C.
2. Después, retirar las placas de la incubadora, lavarlas con un tampón M9 modificado (M9W) y recoger las lombrices en tubos cónicos de 15 mL.
3. Lava los gusanos 3 veces.
4. Retirar la mayor parte del M9W por aspiración y añadir 500 μL de M9W que contiene 2 mM de azida de sodio o 2 mM de cloruro de tetramisol al pellet de gusanos. Esto anestesiará a los gusanos, asegurando que no se produzca ningún movimiento al ser observado bajo el microscopio.
   PRECAUCIÓN: Utilice equipo de protección individual (EPP) al manipular azida de sodio. Prepara la solución de azida bajo una capucha química.
5. Incuba los pellets de gusano a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos. Luego, pon 15 μL de la suspensión con gusillo sobre una almohadilla de agarosa preparada. Coloque suavemente una capa de cobertura nº 1.5 sobre la almohadilla de agarosa que contiene los gusanos anestesiados.
6. Utilizando un microscopio fluorescente, visualiza la localización del factor de transcripción 1 de la familia Skinhead o SKN-1:GFP (SKN-1 marcado con proteína fluorescente verde) utilizando filtros de fluoresceína isotiocianato (FITC) y 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Gusanos de imagen a aumentos de 10x y 20x.
7. Puntua los gusanos según el nivel de localización de SKN-1. No hay localización nuclear, la localización de SKN-1B/C::GFP (ISOFORMA B/C marcada con proteína fluorescente verde) en la parte anterior o posterior del gusano, y la localización nuclear de SKN-1B/C::GFP en todas las células intestinales se clasifican en niveles bajos, medios y altos de localización, respectivamente.
8. Después de puntuar las micrografías fluorescentes, determina las diferencias estadísticas mediante el chi-cuadrado y las pruebas exactas de Fisher usando software estadístico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios y productos químicos
Caldo BD Bacto Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
Tubos centrífugas cónicos estériles de polipropileno de 15 mL	Fisher Scientific	12-565-269
Azida de sodio	Sigma Aldrich	S2002-25G
Cloruro de tetramisol	Sigma Aldrich	L9756
Deslizamientos de tapa nº 1.5 de 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell