Preparación de un modelo de aspiración orofaríngea murina para establecer infecciones bacterianas pulmonares

Resumen

Fuente: Nielsen, T. B., et al., Modelo de aspiración orofaríngea murina de neumonía bacteriana asociada a ventiladores y adquirida en hospital. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo muestra el procedimiento de introducir bacterias a través de la orofaringe hasta los pulmones de un ratón anestesiado para inducir una infección pulmonar y desencadenar una respuesta inmune.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Inocular/Infectar ratones

1. Suspender un ratón anestesiado, colgándolo por sus incisivos superiores en un hilo fuerte y fino (por ejemplo, hilo dental) sujeto a un objeto fijo a una altura aproximadamente el doble de la longitud corporal del ratón (por ejemplo, 20 cm) sobre la superficie operativa (por ejemplo, un banco de laboratorio).
2. Saca suavemente la lengua del ratón de su boca usando pinzas estériles de punta roma. Transfiere la lengua a un dedo estéril enguantado para evitar que el ratón aplaste accidentalmente. Sujeta la lengua fuera de la boca, permitiendo el acceso al orofaringe y evitando que el inóculo se trage hacia un lado.
3. Mientras sostiene la lengua del ratón, colocar el inoculo de 50 μL (suspensión bacteriana) en el orofaringe usando una micropipeta; La orofaringe se encuentra en la unión entre la cavidad oral y la faringe, hacia la parte posterior de la boca.
   NOTA: Es muy importante suministrar líquido solo pipeteando hasta el primer tope de la micropipeta. El ratón dejará de respirar durante unos segundos cuando el inóculo se coloca en la orofaringe; Finalmente, la aspiración refleja hará que el ratón inhale la suspensión bacteriana, indicada por el característico crujido del líquido entrando en los pulmones, lo que provoca una infección por neumonía.
4. Si el inóculo no se coloca lo suficientemente atrás para bloquear la respiración normal, pellizca las narinas con pinzas para forzar la aspiración refleja por la boca y la posterior inhalación del inóculo.
5. Después de la inoculación, libera la lengua, quita al ratón de la cuerda de suspensión, colócalo en una jaula y vigila hasta que despierte de la anestesia.

2. Seguimiento de la progresión de la enfermedad

NOTA: Debido al sufrimiento animal, se deben utilizar varios indicadores para indicar cuándo los ratones se vuelven moribundos; la eutanasia debe realizarse tras esta determinación, de acuerdo con un protocolo previamente aprobado por la IACUC; varios marcadores de moribundidad incluyen la temperatura corporal, la pérdida de peso, la apariencia, la forma de andar y otros biomarcadores que pueden obtenerse de la sangre (por ejemplo, a través de iSTAT).

1. Eutanasia a los ratones según el protocolo IACUC previamente aprobado (por ejemplo, CO₂ seguido de luxación cervical).
2. Extrae los pulmones de un ratón sacrificado cortando la tráquea, la arteria pulmonar y la vena pulmonar cerca de los pulmones.
   1. Microscopía
      1. Coloca los pulmones (o una parte) en un molde de muestra.
      2. Llena el molde de la muestra con compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T.), sumergiendo completamente el tejido.
      3. Congela la muestra a -80 °C.
      4. Envía la muestra a un laboratorio de patología para que la seccione y la monten en láminas para microscopía.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara de Anestesia	Corporación Científica de Kent	VetFlo-0720	Permite hasta 5 ratones
Criomolde, tamaño intermedio	Sakura Tissue-Tek	4566	Moldes desechables de muestras de vinilo, 15×15×5 mm
Hilo dental	Oral-B	37000469537	Ancla al poste estable aproximadamente 6" por encima de la altura de la mesa
Pinzas	VWR	82027-440	Solía sacar suavemente la lengua de la boca del ratón
Isoflurano para anestesia	Abbott	10015516	Se puede usar un fármaco alternativo; modificar el procedimiento en consecuencia
Cartucho iSTAT	Abbott	03P79-25	Hay varios cartuchos disponibles para adaptarse a tus necesidades
Ketamina, 100 mg/mL	Suministro Médico Occidental	4165	Diluye 1:10 en PBS a 1 mg/mL y combina con xilazina a 1 mg/mL
Ungüento para ojos	Akorn	Lágrimas renovadas	Evita tocar a los ojos con la punta del dispensador
Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS)	Corning	21-031-CM	PBS de Dulbecco sin calcio ni magnesio
Puntas de pipeta, 200-μL	VWR	10017-044	Autoclave antes de su uso
Pipetter, 200 μL	Gilson	Pipetman P200	Autoclave y calibración antes de su uso
Propagador, célula bacteriana	Bel-Art	F377360006	Esteriliza horneándola o autoclavando antes de cada uso
Vial, criogénico, 2,0 mL	Corning	430659	Utilizado para el almacenamiento criogénico de inóculos bacterianos concentrados