Tratamiento activado por luz de biopelículas bacterianas utilizando un precursor fotosensibilizante

Resumen

Fuente: Zhao, K., et al. Un modelo in vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por ácido 5-aminolevulínico sobre el biofilm de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)

El vídeo muestra un protocolo de terapia fotodinámica para evaluar los efectos antibacterianos en biopelículas bacterianas Gram-positivas. Las biopelículas se dividen en cuatro grupos: dos reciben un precursor fotosensibilizador y dos reciben un tampón. Todos son incubados en la oscuridad, seguidos de la exposición a la luz roja a un grupo tratado con precursores y a un grupo solo de tampón. Las especies reactivas de oxígeno se generan únicamente en el grupo que recibe tanto precursor como luz, lo que conduce a la muerte celular bacteriana. Se compara la viabilidad entre todos los grupos para evaluar la eficacia del tratamiento.

Protocolo

1. Formación de biofilm

1. Formación de biofilm en microplacas de 96 pozos
   1. Recuperar la cepa USA300 de Staphylococcus aureus y las cepas clínicas formadoras de biofilm 3 (C1-C3) almacenadas a -80 °C.
      NOTA: La capacidad de las cepas clínicas para formar biopelículas se determinó mediante el ensayo de placa microtitulada.
   2. Inocular la bacteria en un medio de 5 mL de caldo de soja de triptona (TSB) y cultivar en una incubadora agitando a 37 °C durante la noche hasta la fase estacionaria.
   3. Centrifuga el cultivo bacteriano durante la noche a 4.000 × g durante 10 minutos a 25 °C y descarta el sobrenadante. Resuspende los pellets en solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 2,0 × 10 unidades formadoras de⁹ colonias (UFC)/mL.
      NOTA: La concentración de la bacteria se estimó midiendo la densidad óptica y se determinó además por el recuento de placas, revelando que 1 OD₆₀₀ de suspensión contenía 1,5 × 10⁸ UFC/mL.
   4. Diluye la suspensión bacteriana a 1:200 (1,0 × 10⁷ UFC/mL) en un medio TSB que contenga 0,5% de glucosa. Inocular 200 μL de suspensión bacteriana en cada pozo de una microplaca de poliestireno de 96 pozos tratada con cultivo celular.
   5. Incubar la microplaca de forma estática a 37 °C durante 24 horas en un ambiente bien oxigenado.
      NOTA: El tiempo de incubación para la formación de biofilm maduro puede variar según las cepas bacterianas; esto debe determinarse antes del experimento de Terapia Fotodinámica (PDT).
   6. Desecha el medio en los pozos y lava suavemente los pozos de microplacas con PBS tres veces y luego descarta el sobrenadante.
      NOTA: El paso debe realizarse con mucha delicadeza para evitar alterar el biofilm formado.

2. Irradiación de luz

1. Guarda el ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) en una nevera a 4 °C. Antes del experimento, diluye 5-ALA con PBS a 10 mM.
   NOTA: La solución de 5-ALA debe prepararse de nuevo antes del experimento.
2. En el grupo experimental, añade 200 μL de 10 mM de ALA a cada pozo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubre el plato/plato con papel de aluminio y incuba durante 1 hora. Luego, irradia la placa/antena con un diodo emisor de luz (LED) con una intensidad luminosa de 100 mW/^cm2 durante 1 hora para lograr una dosis de luz de 360 J/^cm2 a una longitud de onda mayor de 633 ± 10 nm.
   NOTA: Para permitir que la energía lumínica se entregue de forma efectiva e equitativa a la biopelícula en todos los pozos/antenas, fijar la distancia desde el pico de la fuente de luz hasta el pozo/antena en 6,0 cm, y limitar la región experimental al área central de irradiación (10 cm × 8 cm). Para asegurar que los resultados sean reproducibles, los experimentos deben realizarse a la misma temperatura ambiente. En el paso de irradiación LED, para evitar la exposición directa de la placa a otras fuentes de luz, como la luz solar, la iluminación de la habitación o la luz de la lámpara, el LED se encendía antes de mover la placa/antena a la zona de irradiación, y la luz era lo suficientemente brillante para completar la operación.
3. Configura los grupos de control (en nuestro experimento se establecieron tres grupos de control).
   1. Para el primer grupo de control (ALA-LED-), añadir 200 μL de PBS a cada pozo de la microplaca o 2 mL a la antena de cultivo. Cubre el plato/plato con papel de aluminio y déjalo incubar durante 2 horas.
   2. Para el segundo grupo de control (ALA+LED-), añadir 200 μL de 10 mM de ALA a cada pozo de la microplaca o 2 mL a la antena de cultivo. Cubre el plato/plato con papel de aluminio y déjalo incubar durante 2 horas.
   3. Para el tercer grupo control (ALA-LED+), añadir 200 μL de PBS a cada pozo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubre el plato/plato con papel de aluminio y déjalo incubar durante 1 hora. Luego, expone la placa al LED con irradiación de luz de 360 J/^cm2 a una longitud de onda principal de 633 ± 10 nm.
      NOTA: En el paso de irradiación LED, evita la exposición directa de la placa a otras fuentes de luz, como la luz solar, la iluminación de la habitación o la luz de la lámpara.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo de soja de triptona (TSB)	OXOIDE	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	Los kits de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD de BacLight
Yoduro de propidio (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	Los kits de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD de BacLight
Ácido 5-aminolevulínico (ALA)	Bio-Farmácia Fudan Zhangjiang	3.1
Cepa Staphylococcus aureus USA300			Referencias a USA 300
Cepas clínicas de Staphylococcus aureus (C1-C3)			Todas las cepas clínicas se aislaron de pacientes con rinosinusitis crónica
Microplaca de 96 pozos	Corning Inc	3599	Microplacas de poliestireno transparente con fondo plano tratadas con TC, envueltas individualmente, con tapa, estériles
Microcentrífuga Eppendorf 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
Incubadora	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	Agitadores orbitales de mesa MaxQ 4000
Diodo emisor de luz (LED)	Técnica Óptica y Electrónica Yage de Wuhan CO	LED-IB