Preparación de muestras e imagen de bacterias marcadas con fluorescencia

Resumen

Fuente: Chetrit, D., et al. Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver características espaciotemporales del sistema de secreción punto/ icm de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demuestra la preparación e imagen de bacterias patógenas marcadas con fluorescencia. Las almohadillas de agarosa se preparan y colocan primero dentro de un marco adhesivo. Se aplica una suspensión de bacterias genéticamente modificadas que expresan una proteína fluorescente en la almohadilla para inmovilizar las células. El marco se sella con una funda y se observa al microscopio para capturar imágenes de fluorescencia de bacterias.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos que impliquen el crecimiento, manipulación e imagen de L. pneumophila deben realizarse en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2, cumpliendo con las directrices locales.

1. Inserción de sfGFP en el cromosoma Legionella pneumophila mediante estrategia de intercambio alélico y doble selección (Figura 1, Figura 2)

1. Clonar en el vector de reemplazo génico pSR47S11 la siguiente secuencia: la secuencia a 1.000 pb aguas arriba del sitio de interés, luego la secuencia sfGFP y después la secuencia a 1.000 pb aguas abajo del sitio de interés (Figura 1). La secuencia sfGFP debe colocarse en un marco de referencia hacia los extremos N-terminales o C-terminales con un enlace que contenga entre cuatro y ocho aminoácidos. Transformar el vector resultante en Escherichia coli DH5αλpir. Más tarde, se estria L. pneumophila (el receptor) para colonias individuales en agar de extracto de carbón y levadura (CYE) que contenga 100 μg/mL de estreptomicina y cultiva durante 5 días a 37 °C (Figura 2).
2. Haz una raya de L. pneumophila con CYE-agar-estreptomicina y crece durante 2 días a 37 °C (zona abundante). Streak E. coli DH5α transformado con plásmido auxiliar pRK600 (ayudante) sobre agar LB que contiene 25 μg/mL cloranfenicol. Estría la E. coli DH5αλpir (donante) en agar LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina.
3. Realizar apareamiento triparental: incubar una colonia del ayudante, una colonia del donante y del receptor superponiendo parches de las tres cepas sobre una placa de agar CYE sin selección y incubando durante 4–8 horas a 37 °C. Como controles negativos, incubar una mezcla de cepa ayudante+receptora y una mezcla de cepa donante+receptor durante los mismos periodos de tiempo.
4. Suspender las reacciones de apareamiento en 500 μL de la placa_{ddH 2}O. Placa 20 μL y 50 μL de las reacciones en agar CYE que contiene 100 μg/mL de estreptomicina y 10 μg/mL de kanamicina y cultivar durante 5 días a 37 °C. Estrear cuatro de los clones resultantes en agar CYE que contenga 100 μg/mL de estreptomicina y cultivar durante 5 días a 37 °C.
5. Haz una estirada de 16 clones en agar CYE que contenga un 5% de sacarosa y 100 μg/mL de estreptomicina y cultiva durante 5 días a 37 °C. Luego, haz una estría 32 de estos clones en agar CYE que contenga 100 μg/mL de estreptomicina y en agar CYE que contenga 100 μg/mL de estreptomicina y 10 μg/mL de kanamicina y crece durante 5 días a 37 °C.

2. Aislamiento de clones que integraron sfGFP en el cromosoma L. pneumophila

1. Los clones de raya sensibles a la kanamicina en placas CYE-agar-estreptomicina confirman la inserción de sfGFP en el cromosoma mediante reacción en cadena de la polimerasa de colonia (PCR). Utiliza cebadores que sean complementarios al gen sfGFP y a la región cromosómica de interés para amplificar la unión de inserción.
   1. Mezclar 0,5 μL de cada una de las soluciones cebadoras de 10 μM y una colonia hasta un volumen final de 12,5 μL y desnaturalizar durante 10 minutos a 95 °C. Enfriar sobre hielo durante 10 minutos, añadir 12,5 μL de 2 soluciones de mezcla maestra PCR y realizar un análisis PCR.
2. Cultiva zonas abundantes de las colonias aisladas en placas CYE-agar-estreptomicina durante 2 días a 37 °C. Examina los niveles de expresión y la estabilidad de las fusiones de sfGFP mediante inmunoblotting con un anticuerpo anti-GFP.

3. Imagen de células vivas de L. pneumophila con componentes Dot/Icm marcados con fluorescencia

1. Preparación de almohadillas de agarosa
   1. Haz unos 30 mL de una solución de agarosa al 1% baja en derretimiento en agua. Cocina en el microondas en un frasco de cristal durante unos 90 segundos, girando ocasionalmente, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
   2. Coloca dos correderas^{de vidrio} 3 de 22 x 22 x 22 x 0,15 mm en el borde de una diapositiva^{de 25} x 75 x 1,1 mm de 3, una encima de la otra. Apila dos correderas^{de vidrio} más de 22 x 22 x 0,15 mm en el otro borde.
   3. Pipetear aproximadamente 1 mL de la agarosa fundida en la lámina central entre las dos láminas superiores de vidrio, y luego colocar otra lámina de²⁵ x 75 x 1,1 mm 3 encima de la agarosa fundida. Intenta evitar la formación de burbujas de aire. Enfría las láminas a 4 °C durante 15 minutos.
   4. Con un bisturí o cuchilla, corta suavemente la almohadilla en pequeños cuadrados, ~5 x 5^{mm 2}. Fija un marco adhesivo de doble cara de 17 x 28 x 0,25 mm³ en una corredera^{de vidrio} 3 de 25 x 75 x 1,1 mm y coloca varias almohadillas sobre la corredera.
2. Adquisición de imágenes
   NOTA: Se describen los siguientes pasos para un microscopio que está bajo el control de SlideBook 6.0 y equipado con iluminadores de estado sólido, cámara CCD monocroma y un objetivo objetivo de 100x (apertura numérica de 1,4). Si es necesario, utiliza dispositivos de microscopía alternativos con configuraciones de hardware y software adecuadas que puedan personalizarse según la configuración del protocolo.
   1. Disolver una mancha gruesa de L. pneumophila en 1 mL de_{ddH 2O}, vórtice y pipetear 2–3 μL de la dilución sobre las almohadillas. Coloca suavemente un abrigo^{de 50} x 24 x 0,15 mm 3 sobre el armazón adhesivo.
   2. En la ventana de captura ajusta el ND a 180. Ajusta el binning a 2×2 y utiliza el canal de 488 nm para exponer la muestra entre 500 y 1.000 ms. Validar la especificidad de la señal de fluorescencia mediante imágenes de L. pneumophila no marcada con los mismos parámetros (Figura 3).

Resultados

Figura 1: Visión esquemática de la recombinación homóloga y el intercambio alélico utilizados para insertar sfGFP en el cromosoma L. pneumophila.(A) Se realizó un apareamiento triparental entre una cepa aux...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Objetivo 100x Plan Apo (1.4 NA)	Nikon
ASES	Sigma-Aldrich	A9758
Carbón activado	Sigma-Aldrich	C5510
Agarosa GPG/LMP, baja fusión	Bioanalítico estadounidense	AB00981
Agar deshidratado de bacto	BD	214010
Marco génico, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
L-Cisteína	Sigma-Aldrich	C7352
Portaobjetos de cubierta de microscopio 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Portaobjetos de cubierta de microscopio 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Portaobjetos de microscopio 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Innovaciones en Imagen Inteligente
Motor ligero Spectra X	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Extracto de levadura	BD	212750