Establecimiento de un modelo murino de infección por Clostridium difficile

Resumen

Fuente: Winston, J. A., et al. Modelo murino tratado con cefoperazona de la cepa clínicamente relevante de Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo muestra el procedimiento para inocular ratones pretratados con antibióticos con esporas de Clostridium difficile para establecer un modelo murino de infección que estudie la patogénesis y las respuestas del huésped.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Preparación del Inóculo de Esporas de Clostridium difficile y el Gavage Oral de los ratones

NOTA: Los ratones enfrentados a esporas de C. difficile deben ser alojados en una instalación animal de Nivel 2 de Bioseguridad.

1. Obtener un stock de esporas de C. difficile de la cepa deseada (en este caso, R20291) que haya sido preparado y almacenado a 4 °C en agua estéril. Determinar la enumeración de este stock de esporas antes de su uso.
2. Basándose en la concentración conocida (esporas/ml) del stock de esporas, calcula la dilución deseada para obtener 10⁵ esporas por 25 μl. Asegurarse de que el volumen del inóculo sea adecuado para inocular a todos los ratones del experimento (25 μl por ratón), para realizar el número del inóculo (aproximadamente 30 μl) y para tener en cuenta el error de pipeteo.
3. Vortex la espora original de C. difficile . Luego, se vuelve a suspender el volumen calculado (desde el paso 1.2) del material original de esporas de C. difficile en agua estéril dentro de un tubo microcentrífuga con tapa roscada. Realiza esto de forma aeróbica en una campana de flujo laminar. Identifica esta mezcla diluida como el "inoculo de esporas".
4. Coloca el inóculo de esporas en un baño maría a 65 °C y caliéntalo durante 20 minutos.
   NOTA: Este paso garantizará que solo queden esporas activas de C. difficile tras el tratamiento térmico.
5. Dentro de la campana de flujo laminar, toma 50 μl de inóculo de esporas calentadas, colócalos en un tubo estéril de microcentrífuga y pasa a la cámara anaeróbica. Utiliza esta muestra para la enumeración de esporas.
6. Dentro de la capucha de flujo laminar, carga el inóculo de esporas calentado restante en una jeringuilla de 1 ml unida a una aguja gástrica estéril con punta de bulbo. Utiliza un paso paso a paso con jeringuilla manual para asegurar una dosificación rápida y precisa entre ratones. Asegúrate de que la aguja del gavage esté llena con el inóculo de esporas calentado antes de usarla.
   NOTA: No es necesario usar una nueva aguja estéril para cada ratón. Sin embargo, si se administran varias dosis de esporas de C. difficile , se recomienda una nueva aguja de gavage para cada dosis.
   NOTA: Las esporas de C. difficile son altamente resistentes a los desinfectantes tradicionales. Por lo tanto, es necesario el uso de un desinfectante esporcida, como el desinfectante esporicida #62 Perisept. El fabricante recomienda un tiempo de contacto de 2 minutos para destruir las esporas de C. difficile .
7. Aplica 25 μl del inóculo de esporas a cada ratón. Sujeta suavemente a cada ratón sujetándolo por la piel suelta del cuello y la espalda para inmovilizar la cabeza. Usar el dedo índice inmoviliza aún más la cabeza del animal y alarga el esófago. Asegúrate de que el animal no vocalice ni muestre otros signos de malestar durante la inmovilización.
   NOTA: El volumen total dado a los ratones por gavage no debe superar los 10 ml/kg de peso corporal (0,1 ml/10 g).
8. Mantén al ratón en posición vertical y coloca suavemente la aguja de gavage en el lateral de la boca. Dirige la aguja de gavage a lo largo del paladar y avanza lentamente hacia el esófago.
   NOTA: Si se encuentra alguna resistencia, la aguja de gavage puede estar entrando en la tráquea y, por tanto, NO debe adelantarse, sino retirarse y reposicionarse inmediatamente.
9. Cuando la aguja de gavage esté aproximadamente a mitad de camino dentro del esófago, inyecta 25 μl del inóculo de esporas calentadas y retira suavemente la aguja de gavage del esófago.
   NOTA: El avance brusco de la aguja del gavage puede provocar la ruptura del esófago o del estómago. Por lo tanto, si se encuentra resistencia al avanzar la aguja de gavage, es mejor retirarla y volver a posicionarla de inmediato.
10. Devuelve al animal a su jaula y obsérvalo si tos o signos de dificultad respiratoria pueden ser detectados, ya que esto puede indicar una administración traqueal involuntaria o aspiración del inóculo de esporas calentadas.
    NOTA: Los ratones son extremadamente susceptibles a C. difficile tras el tratamiento antibiótico; Por lo tanto, son esenciales tomar precauciones para evitar la contaminación cruzada entre jaulas. Esto es especialmente importante al tratar ratones tratados con antibióticos pero sin cuestionar como controles.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Limpiador desinfectante esporicial perisept #62	SSS Navigator	48027	Este producto requerirá dilución según lo recomendado por el fabricante
Ratones C57BL/6J	El Laboratorio Jackson	664	Los ratones deberían tener entre 5 y 8 semanas de edad
Tapa de rosca micro centrifugadora de 2 ml	Corning	430917