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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
- Obtención de muestras para la enumeración de Clostridium difficile (C. difficile)
NOTA: Antes de obtener contenido de heces o cecal, pesa tubos estériles de microcentrífuga en una báscula analítica. Anota el peso del tubo en el lateral del tubo, redondeando a cuatro decimales (por ejemplo, 0,9864 g). Denota este peso como el "peso del tubo". Cada muestra recogida debe colocarse en un tubo de microcentrífuga estéril y pesado.
1. Colección estéril de heces de ratón- Sujeta suavemente a cada ratón sujetándolo por la piel suelta del cuello y la espalda para inmovilizar la cabeza. Utiliza el dedo meñique para sujetar suavemente la cola del animal, dejando así el ano al descubierto. Asegúrate de que el animal no vocalice ni muestre otros signos de malestar durante la inmovilización.
- Sujeta un tubo de microcentrífuga estéril y pesado justo debajo del ano del animal. Es imprescindible que el tubo no entre en contacto directo con el ratón.
- Mientras el animal defeca, recoge la pellet fecal en el tubo. Mantén el tubo a temperatura ambiente hasta que se recojan todas las muestras fecales. Puede tardar varios minutos en defecar un ratón, lo que obliga a intentar repetidamente recoger heces.
- Pesa los tubos que contienen heces en la báscula analítica. Anota el peso del tubo, redondeando a cuatro decimales (por ejemplo, 1,0021 g). Denota el peso obtenido como el "peso final del tubo".
- Pasar las muestras fecales a la cámara anaeróbica para la enumeración bacteriana inmediatamente después de la recogida de heces.
- Enumeración bacteriana de C. difficile
- Calcula el peso final del contenido (heces) que se enumerará para C. difficile. Se hacía restando el "peso final del tubo" del "peso del tubo".
- Calcular una dilución 1:10 del contenido en 1X solución salina tamponada con fosfato (PBS) y resuspender en consecuencia. Para los pellets fecales, utiliza la punta de la pipeta para desintegrar suavemente el pellet y convertirlo en solución.
- Incubar anaerobicamente estas muestras resuspendidas a temperatura ambiente durante 30 minutos, permitiendo que su contenido se asiente.
- Realizar diluciones seriadas para cada muestra en 1x PBS para enumerar las unidades formadoras de colonias (UFC) por g de contenido (heces). Haz esto de forma anaeróbica.
- Utilizando la técnica aséptica, transfiere 100 μl de cada dilución serial a placas de agar de cefoxitina cefoxitina (TCCFA) taurocolato. Utilizando un esparcidor estéril en forma de L, extiende la dilución aplicada sobre el medio para distribuirlo uniformemente por la placa. Una dispersión uniforme de la dilución es esencial para un número preciso de colonias.
- Incuba las placas anaeróbicamente durante 24 horas a 37 °C. En este momento, enumerar las colonias de C. difficile para obtener la CFU por g de contenido (heces). Las colonias de C. difficile son planas y de color amarillo pálido, presentan bordes irregulares y un aspecto de vidrio esmolado.
NOTA: Este protocolo puede utilizarse para enumerar C. difficile a partir de otros contenidos gastrointestinales (GI) murinos, incluyendo el contenido ileal y colónico. Las placas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden utilizarse para producir diluciones en serie.