Ensayo basado en fluorescencia para investigar las interacciones de los receptores de macrófagos con antígenos bacterianos

Resumen

Fuente: Barbero, A. M., et.al. Ensayos de fluorescencia para el estudio de la interacción de Mycobacterium tuberculosis con el receptor inmunitario SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)

Este vídeo muestra un ensayo basado en fluorescencia para estudiar la interacción entre un receptor de macrófagos y antígenos de Mycobacterium tuberculosis . Los antígenos marcados con fluorescencia en un abrigo se incuban con extractos de proteínas de macrófagos, se reticulan, se marcan con anticuerpos y se visualizan mediante señales de fluorescencia superpuestas.

Protocolo

1. Interacción entre Mycobacterium tuberculosis y SLAMF1 mediante microscopía de fluorescencia

1. Reticulo bacteria-proteína
   1. Introduce cubiertas redondas de 12 mm en placas de cultivo de 24 pozos (1 cubierta por pozo) usando pinzas quirúrgicas de punta redonda.
      NOTA: Limpia bien las cubiertas con etanol al 70%. Si se desea, pueden ser autoclavadas o esterilizadas bajo luz ultravioleta durante 30 minutos.
   2. Incubar el cubo con 400 μL de 10 μg/mL de poli-D-lisina durante la noche a 4 °C. Cubrir la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz.
   3. Al día siguiente, saca el plato de la nevera y lava la cubierta dos veces con 1 mL de agua.
   4. Deja que la funda se seque.
   5. Diluir 20 μL (2 x 10⁶) de Mtb-R Ags en 180 μL de 1x PBS. Los últimos 200 μL son suficientes para cubrir completamente un deslizamiento de cobertura.
   6. Incubar el deslizante de cobertura con Mtb-R Ags durante 1 hora a 37 °C en una incubadora celular.
   7. Desecha el líquido restante y lava dos veces con 1 mL de 1 PBS (solución salina tamponada con fosfato).
      NOTA: En este paso, la correcta adhesión de Mtb-R al abrigo puede comprobarse con un microscopio de fluorescencia utilizando los filtros correspondientes al canal rojo.
   8. Añade 400 μL de buffer bloqueante (suero bovino fetal al 10% (FBS) en 1x solución fisiológica con fosfato (PBS) durante 30 minutos en RT en agitación (shaker).
   9. Lava dos veces con 400 μL de buffer bloqueante.
   10. Incubar con 100 μL de extracto proteico diluido en 300 μL de 1x PBS durante 2 horas en RT en agitación (shaker).
   11. Añade 400 μL de formaldehído al 1% diluido en 1x PBS. Incubar durante 15 minutos bajo agitación (shaker) en RT.
   12. Añade 500 μL de glicina 0,125 M diluida en agua. Incubar durante 5 minutos bajo agitación (shaker) en RT.
   13. Lava dos veces con 1 mL de 1 PBS 1.
   14. Añade 400 μL de 2 mM de bis(succinimidilsuccinato) de etilenglicol (EGS) durante 1 hora en la RT en agitación (agitador).
   15. Repite el paso 1.1.13
       NOTA: Se recomienda encarecidamente la preparación de los reactivos en el momento de su uso.
2. Tinción SLAMF1
   1. Envuelva la tapa de la placa de cultivo en película de parafina.
   2. Añadir una gota de 60 μL de anticuerpo primario anti-SLAMF1 previamente titulado (dilución 1:75) sobre la tapa cubierta con película de parafina.
   3. Retira cuidadosamente la funda de la placa usando pinzas quirúrgicas curvas de punta fina y agujas.
      NOTA: Para facilitar la extracción del deslizamiento, la aguja puede doblarse en un ángulo aproximado de 45°.
   4. Invierte el coverslip sobre la gota que contiene el anticuerpo. Incubar durante 30 minutos en descanso en la oscuridad.
   5. Levanta la cubierta y lávate dos veces con el amortiguador bloqueador.
   6. Invierte el slip sobre una nueva gota que contiene el anticuerpo secundario (dilución 1:200). Incubar durante 30 minutos en descanso en la oscuridad.
   7. Repite el paso 1.2.5.
   8. Retira el exceso de líquido y monta la cubierta sobre una gota de líquido de montaje colocada sobre una lámina de cristal.
   9. Observa bajo el microscopio de fluorescencia utilizando filtros adecuados.
      NOTA: Se recomienda trabajar en condiciones estériles. Diluye los anticuerpos en el buffer bloqueante. Manipula la capa con cuidado para evitar arañazos que puedan dificultar la observación bajo el microscopio. Se recomienda encarecidamente un fluido de montaje adecuado para la fluorescencia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo secundario Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21121	Para microscopía de fluorescencia
Anticuerpo primario anti-SLAMF1	BioLegend	306302	Para microscopía de fluorescencia
Aqua-Poly/Mount	Policiencias	18606-20	Medios de montaje
Cubiertas 12mm	HDA	-	Para ensayo de interacción por microscopía
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Para el tratamiento de reticulación
Formaldehído	Merck	K47740803613	Para el tratamiento de reticulación
Correderos de vidrio	Glass Klass	-	Para ensayo de interacción por microscopía
Glicina	Sigma	G8898	Para el tratamiento de reticulación
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Microscopio de fluorescencia con módulo de iluminación Colibri 7
Poli-D-lisina	Sigma Aldrich	A-003-M	Para el tratamiento de las cubiertas
Rodamina B	Sigma Aldrich	21955	Para M. Tinción por tuberculosis