Desarrollo de un modelo de infección larvaria de pez cebra usando microgavage

Resumen

Fuente: Li, J., et al. Desarrollo de un modelo larvario de infección por peces cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo muestra el procedimiento de microgavage, en el que una larva de pez cebra anestesiada es inmovilizada en agarosa e inyectada oralmente con una bacteria patógena usando una aguja guiada por trazadores. El parto no invasivo imita la infección natural, permitiendo analizar la replicación bacteriana, la liberación de toxinas y el daño epitelial intestinal.

Protocolo

1. Gavage de larvas de pez cebra

1. Calibra la aguja microgavage.
2. Mide el diámetro de la punta de la aguja colocando la aguja sobre un portaobjetos de calibración con una gota de aceite mineral. Asegúrate de que la punta tenga entre 30 y 40 μm de diámetro, roma y lisa. Descarta las agujas afiladas o ásperas.
   NOTA: Los filos afilados de las agujas pueden embotarse con fuego rápido.
3. Prepara la solución de gavage.
4. Carga y monta la aguja en un micromanipulador.
5. Ajusta el micromanipulador para colocar la aguja en un ángulo de 45°.
6. Anestesiar las larvas del pez cebra. Cuando las larvas dejan de moverse, transfieras a la ranura de un molde microgavage usando una pipeta Pasteur.
7. Coloca una gota de agarosa de baja fusión al 0,8% sobre las larvas de pez cebra para cubrirla. Ajusta suavemente las larvas con las cabezas erguidas en ángulos de 45° en la ranura y las colas contra la pared de la ranura. Asegúrate de que los ángulos de las cabezas sean aproximadamente iguales para que estén alineados con el ángulo de las agujas de gavage. Colocar el moho microgavage sobre hielo durante 30–60 segundos, permitiendo que la agarosa de baja fusión se solidifique para estabilizar las posiciones de las larvas.
8. Ajusta la presión de inyección entre 200 y 300 hPa. Ajusta el tiempo de inyección a 0,1–0,3 s para obtener un volumen de inyección de 3–5 nL de Clostridioides difficile.
9. Acciona suavemente la aguja a través de la agarosa, luego hacia la boca de las larvas de pez cebra, y a través del esófago. Una vez que la punta de la aguja está dentro del bulbo intestinal anterior, presiona el pedal de inyección para liberar las bacterias. Llena la luz del intestino con el volumen entregado. No dejes que se desborde del esófago o la cloaca. Retira suavemente la aguja de la boca del pez cebra.
10. Tras el vaivante, rescata las larvas infectadas de pez cebra de la agarosa con una punta microcargadora flexible, primero cortando la agarosa y luego levantando las larvas. Transfiere estas larvas a un medio de Danieau estéril al 30%. Enjuaga las larvas en medio estéril dos veces. Transfiere las larvas a una placa de Petri fresca de 10 cm. Las larvas se mantendrán hasta 11 días después de la fertilización (dpf).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Agarosa de gelificación ultra baja
Fusión baja de agarosa (LM)	Pronadisa	8050	Se utiliza en placas de agarosa
Vidrio capilar	Aparato de Harvard	30-0019	Agujas de inyección
Clostridioides difficile			R20291, una cepa ribotipo 027, producción TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIYI	Plataforma de código abierto		Procesamiento de imágenes
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Tirador de aguja horizontal	Sutter instrument Inc	P-87
L-cisteína	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Procesamiento de imágenes
Microinyector	eppendorf	5253000017
Moldes de microinyección	Herramientas de Ciencia Adaptativa	TU1
Microscopio confocal Leica SP8	Leica
Rojo fenólico	Sigma-Aldrich	P0290
Cloruro de potasio (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Cloruro de sodio (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocolado	Carl Roth GmbH	8149
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Extracto de levadura	BD Bacto	212750