Inoculación de un patógeno bacteriano en hojas de Arabidopsis mediante infiltración al vacío

Resumen

Fuente: Rufián, J. S., et.al. Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demuestra un método de infiltración por vacío para introducir un patógeno bacteriano en las hojas de las plantas de Arabidopsis . El enfoque utiliza una suspensión bacteriana preparada y pulsos de vacío para permitir una entrada uniforme a través de estomas, lo que resulta en una infección controlada de las hojas.

Protocolo

1. Inoculación de plantas de Arabidopsis

NOTA: En este estudio, las cepas Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 y P. syringae pv. se utilizaron phaseolicola 1448A.

1. Prepara el inoculum de P. syringae .
   1. Estirar la cepa de P. syringae de interés de un stock de glicerol a −80 °C sobre una placa LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 16 g/L de agar bacteriológico) suplementada con los antibióticos adecuados. Incubar a 28 °C durante 40-48 horas.
      NOTA: Se recomienda el uso de antibióticos si la cepa de interés lleva un plásmido o un gen de resistencia genómica. Las concentraciones recomendadas de antibióticos para P. syringae son las siguientes: kanamicina (15 μg/mL), gentamicina (10 μg/mL), ampicilina (300 μg/mL).
   2. Raspa la biomasa bacteriana y vuelve a suspender en 5 mL de 10 mM de_{MgCl 2}. Mide el diámetro_{exterior 600} y ajusta a 0,1 añadiendo 10 mM de_{MgCl 2}.
      NOTA: Un OD₆₀₀ de 0,1 de un cultivo de P. syringae corresponde a 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹.
   3. Realizar diluciones en serie en 10 mM de_MgCl2 para alcanzar una concentración final de inoculo de 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Prepara 200 mL de inóculo para las plantas de Arabidopsis .
   4. Justo antes de la inoculación, añade el tensioactivo Silwett L-77 a una concentración final del 0,01% para Arabidopsis. Cabe señalar que Silwett es algo perjudicial para el tejido de Arabidopsis .
2. Realiza infiltración por vacío.
   1. Para la infiltración de Arabidopsis, coloque dos palos de madera formando una X sobre la maceta (Figura 1E) y coloque la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 cm de diámetro que contiene el inoculo de 200 mL (Figura 1F).
   2. Insertar las plantas sumergidas en la solución del inoculo en una cámara de vacío (Figura 1G) y administrar un pulso de 500 mbar durante 30 segundos para infiltrar las hojas. Repite el pulso de vacío 2-3 veces hasta que la hoja esté completamente infiltrada (Figura 1H).
   3. Drena el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devuelvo las plantas a su cámara de crecimiento correspondiente.

Resultados

Figura 1: Inoculación bacteriana y extracción de apoplastos utilizando plantas de Arabidopsis . (A) Preparación de la olla con la malla metálica correctamente sujeta. (B) Sembrar semillas con un pal...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de Petri de 140 mm			No hay requisitos especiales
Agar bacteriológico	Roko
Sulfato de gentamicina	Duchefa	G-0124
Monosulfato de kanamicina	Fitotecnología	K378
MgCl₂	Merk
NaCl	Merk
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Triptona	Merk
Cámara de vacío de 25 cm de diámetro	Kartell	554
Bomba de vacío	GAST	DOA-P504-BN
Extracto de levadura	Merk
Ampicilina sódica	GoldBio