Imagen de alto rendimiento de la infección intracelular por Brucella abortus en células epiteliales del hospedador

Resumen

Fuente: Casanova, A., et al. Ensayos basados en microscopía para el cribado de alto rendimiento de factores del huésped implicados en la infección por Brucella en células Hela. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra imágenes de alto rendimiento de la infección por Brucella abortus en células epiteliales con knockdown STING mediado por SIRNA para investigar el papel de la detección del ADN citosólico en la replicación intracelular bacteriana y la respuesta inmunitaria innata del huésped.

Protocolo

1. Infección y fijación

1. Un día antes de la infección, inocúla la cantidad determinada de cultivo inicial de B. abortus en un medio de 50 ml TSB/Km (Caldo de Soja Tríptico que contiene 50 μg/ml de kanamicina) en un frasco de 250 ml con tapón de rosca. Sella el frasco con Parafilm y cultiva bacterias durante la noche a 37 °C y 100 rpm en un agitador orbital hasta OD₆₀₀ = 0,8-1,1.
2. Mide el OD₆₀₀ del cultivo bacteriano y prepara el medio de infección diluyendo el cultivo bacteriano en DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco) /10% FCS (suero fetal de ternero) para lograr la multiplicidad deseada de infección (MOI).
   NOTA: Para obtener una tasa de infección del 5-10% en células HeLa, se utiliza un MOI de 10.000. Se debe realizar una curva de titulación MOI para cada tipo celular para obtener tasas óptimas de infección.
3. Intercambia el medio de transfección de la placa de 384 pozos por 50 μl del medio de infección mediante un lavador automático de placas.
4. Centrifuga la placa de 384 pozos a 400 x g y 4 °C durante 20 minutos.
   NOTA: Esto ayuda a sincronizar el proceso de infección.
5. Sella la placa con Parafilm e incubala sobre una placa de aluminio precalentada en una incubadora húmeda a 37 °C con 5% de_CO2 durante 4 horas.
6. Lava las células con DMEM/10% de FCS que contienen 100 μg/ml de Gm (gentamicina) para inactivar bacterias extracelulares usando la lavadora automática de placas (usa 200 μl/lavado de desbordamiento de pozo).
   NOTA: Durante un lavado por desbordamiento, la lavadora automática de placas dispensa y aspira el medio simultáneamente.
7. Para el ensayo de entrada, lava las celdas una segunda vez con DMEM/10% FCS que contengan 100 μg/ml Gm y 100 ng/ml de aTc usando la lavadora automática de placas (usar 200 μl/lavado de desbordamiento de pozo).
8. Sellar la placa con parafilm y devolverla a una placa de aluminio precalentada en la incubadora húmeda de 37 °C con 5% de_CO2 durante otras 40 o 4 horas, respectivamente para el ensayo final y el ensayo de entrada.
9. Para la fijación, lava los pozos con PBS (solución salina con fosfato) usando la lavadora automática de placas (usa 200 μl/lavado de desbordamiento de pozo).
10. Intercambiar PBS con 50 μl de paraformaldehído (PFA) al 3,7% en un HEPES de 0,2 M a pH 7,4 utilizando la lavadora automática de placas.
    NOTA: Precaución: La PFA es tóxica por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere.
11. Incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente.
12. Cambiar el medio de fijación por un PBS de 50 μl usando la arandela automática de placas.
    NOTA: Las muestras ya están listas para ser extraídas del BSL3 si es necesario.
    PRECAUCIÓN: La extracción de cualquier muestra de una instalación BSL3 (Nivel de Bioseguridad 3) está sujeta a la evaluación de riesgos y validación del procedimiento y depende de las normativas aplicables en materia de bioseguridad.

2. Tinción

1. Lava las células dos veces con PBS de 50 μl.
2. Permeabiliza las células en 50 μl 0,1% de Tritón-X-100 en PBS durante 10 minutos.
3. Lava las células tres veces con PBS. Añadir 20 μl de PBS que contiene 1 μg/ml de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Lava las células tres veces en PBS y protege las manchas de la luz con papel de aluminio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo de Soja Tríptico (TSB)	Fluka	22092
Sulfato de kanamicina	Sigma-Aldrich	60615
Botella de 250 ml con tapa de rosca	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Suero fetal para terneros (FCS)	Gibco	10270	Inactivación por calor
Placa Greiner CELLSTAR de 384 pozos	Sigma-Aldrich	M2062
Papel de aluminio pelable	Compañero de reparto	6570
Dispensador de reactivos: "Dispensador de reactivos Multidrop 384"	Termo Científica	5840150	Se puede utilizar un dispensador de reactivos alternativos.
Reactivo de transfección: "Lipofectamina RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Arandela automática: "Arandela ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Esta arandela de placas contiene un colector de 16 canales adecuado para placas de 384 pozos. Cabe en un armario de bioseguridad y tiene una tapa que cubre la placa durante el lavado, lo que reduce el riesgo de producción de aerosoles. Se podrían usar arandelas de placas alternativas con características similares.
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	Disuelve en 0,2 M de tampón HEPES, pH 7,4. Guárdalos a -20 °C y descongelar frescos el día antes de usarlos. Precaución, la PFA es tóxica por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
SiRNA de Kif11	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Dispositivos moleculares	IXM IMAGING MSCOPE	Microscopio automático de imagen celular equipado con una etapa en Z motorizada de precisión. Se pueden emplear sistemas alternativos para microscopía automatizada y componentes alternativos para hardware y software especificados a continuación.