Detección de la susceptibilidad a antibióticos bacterianos mediante un microscopio Raman de dispersión estimulado

Resumen

Fuente: Zhang, M. et al., Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimulada de incorporación de deuterio en una sola bacteria. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demuestra la aplicación de la microscopía de dispersión Raman estimulada para evaluar la susceptibilidad a los antibióticos mediante el seguimiento de la actividad metabólica marcada con deuterio. Al monitorizar señales de carbono-deuterio, el método permite la detección rápida de poblaciones bacterianas resistentes y susceptibles.

Protocolo

1. D₂Tratamiento de incorporación de O en presencia de antibióticos (Figura 1a)

1. Comprueba la concentración bacteriana midiendo la densidad óptica (OD) con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
2. Diluir la solución bacteriana utilizando el medio normal de caldo Mueller-Hinton (MHB), que no contiene deuterio, para alcanzar una concentración celular final de 8 x 10⁵ UFC/mL. Haz un vórtice suave para mezclar las células bacterianas.
3. Preparar 300 μL de alícuotas de la solución bacteriana en siete microtubos de 1,5 mL, y 600 μL de alícuotas de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 mL.
4. Añadir 4,8 μL de solución antibiótica (gentamicina o amoxicilina) en stock (1 mg/mL) en el microtubo que contiene 600 μL de la solución bacteriana, para alcanzar la concentración final de antibiótico a 8 μg/mL.
5. Extrae 300 μL de solución de los 8 μg/mL de solución bacteriana que contiene antibióticos y añade otros 300 μL de solución bacteriana para obtener una solución bacteriana diluida en doble cantidad (4 μg/mL).
6. Repite la dilución en serie doble de los antibióticos de prueba, gentamicina o amoxicilina, hasta alcanzar el microtubo con la concentración más baja (0,25 μg/mL), y se descartan 300 μL del tubo. Para tanto la gentamicina como para la amoxicilina, las concentraciones seriadas oscilan entre 0,25 μg/mL y 8 μg/mL.
   1. Deja un tubo sin antibióticos para el control en blanco. Este será el control positivo para inspeccionar la actividad metabólica bacteriana sin tratamiento con antibióticos, pero con tratamiento con_D2O.
   2. Deja una sonda sin antibióticos y sin vitamina_2Opara el control negativo.
7. Incubar la alícuota bacteriana con un concreto antibiótico (gentamicina o amoxicilina) que contenga un medio MHB durante 1 hora.
8. Durante la incubación, preparar una dilución en serie de antibióticos con un medio que contiene 100%_D2Oy el mismo gradiente de concentración de antibióticos preparados en el paso 1.6. Para tanto la gentamicina como para la amoxicilina, las concentraciones seriadas oscilan entre 0,25 μg/mL y 8 μg/mL.
9. Tras 1 hora de tratamiento antibiótico, añadir 700 μL de antibiótico diluido en serie y un medio MHB que contiene 100% D₂O a los 300 μL de bacterias pretratadas con antibiótico en la misma concentración (preparado en el paso 1.6), respectivamente.
   1. Por ejemplo, añadir 700 μL de medio MHB que contiene 100% D₂O (que contiene 8 μg/mL de antibiótico) a los 300 μL de bacterias pretratadas con antibióticos de 8 μg/mL. De la misma manera, transfiere a los tubos correspondientes de la siguiente concentración y homogeneiza pipeteando varias veces hacia arriba y hacia abajo.
   2. Añadir 700 μL de medio MHB 100% con D₂O libre de antibióticos a 300 μL de bacterias libres de antibióticos (preparadas en el paso 1.6.1) como control en blanco.
   3. Incubar a 37 °C en un shaker de incubación a 200 rpm durante 30 minutos adicionales.
      NOTA: En este paso, la concentración final de D₂O en el medio para la prueba es del 70%.
10. Primero centrifuga 1 mL de antibiótico y la muestra bacteriana tratada con D₂O a 6200 x g durante 5 minutos a 4 °C, y después lava dos veces con agua purificada. Finalmente, fija muestras en una solución de formol al 10% y almóntalas a 4 °C.

2. imágenes por dispersión Raman estimulada (SRS) de la incorporación metabólica de D₂O en una sola bacteria

1. Lava 1 mL de solución bacteriana fija con agua purificada y luego centrifuga a 6200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Retira el sobrenadante. Enriquece la solución bacteriana hasta unos 20 μL.
2. Deposita la solución bacteriana sobre un tapa de vidrio recubierto de poli-L-lisina. Sándwich y sella la muestra para la imagen SRS.
3. Imágenes de bacterias a la frecuencia vibracional C-D de 2168 cm-1 usando un microscopio SRS.
   1. Introduce y ajusta la longitud de onda de la bomba a 852 nm usando el software de control del ordenador.
   2. Mide la potencia del láser usando un medidor de potencia. Ajusta la potencia del láser de bombeo en la muestra a ~8 mW y la potencia del láser Stokes en la muestra a ~40 mW ajustando la placa de media onda delante de la salida del láser.
      NOTA: En el microscopio SRS, un láser sintonizable de femtosegundos con una frecuencia de repetición de 80 MHz proporciona los láseres de excitación de bombeo (680 a 1300 nm) y Stokes (1045 nm).
4. Ajustando los tornillos de los espejos de reflexión, alinear espacialmente los haces de bomba y Stokes y dirigir los dos haces hacia un microscopio vertical equipado con un sistema de espejo galvo 2D para escaneo láser.
   1. Usa un objetivo de inmersión en agua 60x para enfocar la bomba y los láseres Stokes en la muestra.
   2. Utiliza un condensador de aceite para recoger las señales de la muestra en dirección directa.
   3. Utiliza un filtro pasa banda para filtrar el láser Stokes antes de dirigirlo hacia un fotodiodo.
   4. Extrae la señal Raman estimulada mediante un amplificador de bloqueo y detecta las señales mediante un fotodiodo.
5. Configura cada imagen SRS para que contenga 200 x 200 píxeles y el tiempo de permanencia de los píxeles para 30 μs en el panel de control del software. El tiempo total de adquisición para una imagen es de ~1,2 s. Ajusta el tamaño del Step a 150 nm, de modo que el tamaño de la imagen sea de aproximadamente 30 x 30^{μm 2}. Imagina al menos tres campos de visión para cada muestra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Modulación acusto-óptica	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulación del haz láser Stokes
Amoxicilina	Sigma Aldrich	A8523-5G
Filtro pasa banda	Chroma	HQ825/150m	Bloquea el haz láser Stokes antes del fotodiodo
Cloruro de calcio	Sigma Aldrich	C1016-100G	Ajuste de cationes
Caldo Mueller-Hinton ajustado por cationes	Fisher Scientific	B12322	Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos mediante métodos de dilución de caldo
Centrifugadora	Termo Científica	75002542
Gafas de cubierta	VWR	16004-318
Tubo de cultivo con tapa de chasquido	Marca Fisher	149569B
Óxido de deuterio		151882	Disolvente orgánico para disolver antibióticos
Óxido de deuterio-d6	Sigma Aldrich	156914	Disolvente orgánico como estándar para calibrar sistemas de imagen SRS
Escherichia coli BW 25113	El Centro de Stock Genético de Coli	7636
Tubos microcentrífugas de polipropileno Eppendorf 1,5 mL	Marca Fisher	05-408-129
Sulfato de gentamicina	Sigma Aldrich	G4918
Filtros hidrofílicos de polivinilideno fluoruro	Millipore-Sigma	SLSV025NB	Tamaño de poro 5 μm
Láser pulsado de femtosegundos InSight DeepSee	Espectros-Física	Modelo: insight X3	Fuente láser sintonizable y fuente láser fija a 1045 nm para imágenes SRS
Amplificador de bloqueo	Instrumento de Zúrich	HF2LI	Demodular las señales SRS
Condensador de aceite	Olimpo	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 47085
Fotodiodo	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Tubo cónico de polipropileno 15 mL	Halcón	14-959-53A
Filtros de polipropileno	Termo Científica	726-2520	tamaño de poro 0,2 μm
Placas de Petri estériles	Corning	07-202-031
Jeringuilla 10 mL	Marca Fisher	14955459
Espectrofotómetro UV/Vis	Beckman Coulter	Modelo: DU 530	Medición de la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm
Mezclador de vórtice	VWR	97043-562
Objetivo del agua	Olimpo	UPLANAPO/IR	60×, NA 1,2